3' ARNm-seq

La secuenciación de ARNm en el extremo 3' (3' mRNA-seq) es una técnica transcriptómica cuantitativa a nivel genómico basada en la codificación de barras de la región no traducida 3' (UTR) de las moléculas de ARNm . A diferencia de la secuenciación de ARN masiva estándar (3' mRNA-seq) , donde se generan lecturas de secuenciación cortas a lo largo de toda la longitud de los transcritos de ARNm, en 3' mRNA-seq solo se secuencia el extremo 3' de los ARN poliadenilados . Este enfoque permite cuantificar la expresión de un gen con un menor número de lecturas y reduce la profundidad de secuenciación requerida por muestra, a la vez que proporciona lecturas de los niveles de expresión génica robustas y fiables a nivel de todo el transcriptoma, comparables a los métodos de secuenciación de ARN de longitud completa. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

El código de barras de las muestras y la menor profundidad de secuenciación por muestra también permiten mayores niveles de multiplexación de muestras por experimento y reducen el costo de la secuenciación del transcriptoma en comparación con los métodos de secuenciación de ARN de longitud completa. Estos factores son cruciales para estudios de expresión génica a gran escala y de ultra alto rendimiento, o para estudios que evalúan la expresión génica diferencial entre diferentes condiciones experimentales o tipos de células. ^{[ 2 ]}

Algunas tecnologías de secuenciación de ARNm 3', como la codificación y secuenciación de ARN masivo (BRB-seq) comercializada por Alithea Genomics, simplifican aún más el proceso de preparación de la biblioteca al agrupar hasta 384 muestras muy temprano en el flujo de trabajo a un costo por muestra equivalente al perfilado de cuatro genes individuales utilizando qRT-PCR convencional, en un flujo de trabajo que requiere menos de dos horas y media de tiempo de trabajo manual. ^{[ 2 ]} Un número creciente de técnicas de secuenciación de ARNm 3' también incluyen identificadores moleculares únicos (UMI) en los códigos de barras de las muestras para etiquetar de forma única cada molécula de ARNm y para distinguir entre los transcritos de ARNm originales y los duplicados que resultan de la amplificación por PCR .

El método de codificación de muestras utilizado en la secuenciación de ARNm 3' se estableció por primera vez en el campo de la transcriptómica de células individuales , donde la codificación de muestras y ARNm permitió multiplexar cientos o miles de células individuales en un solo experimento. ^{[ 3 ]} Las tecnologías de perfilado de ARN de células individuales como CEL-seq2, SCRB-seq y STRT-seq también permitieron agrupar grandes conjuntos de muestras en una única biblioteca de secuenciación en una etapa temprana del protocolo debido a la adición de códigos de barras de muestras que reconocen la cola poli(A) 3' de las moléculas de ARNm. ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

Sin embargo, si bien las primeras versiones de los métodos de secuenciación de ARNm 3' empleaban el cebado con oligo-dT para enriquecer las regiones poli(A) 3' de las moléculas de ARNm, a menudo no incluían la opción de multiplexar muestras al inicio del flujo de trabajo ni de incluir UMI para corregir errores de amplificación (Moll et al., 2014). Las versiones y mejoras posteriores del método ahora suelen incluir combinaciones de UMI y códigos de barras de muestra, con flujos de trabajo optimizados específicamente para la multiplexación temprana y adecuados para experimentos de secuenciación de ultra alto rendimiento. ^{[ 2 ]}

Existen numerosos métodos de secuenciación de ARNm 3', como BRB-seq, QuantSeq, 3'Pool-seq, TagSeq y QIAseq. ^{[ 2 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}

Cada método se basa en un paso inicial de transcripción inversa en el que los ARNm se marcan con códigos de barras de muestra. La transcripción inversa se puede realizar con cebadores oligo dT, cebadores oligo dT con código de barras u oligos de cambio de plantilla. ^{[ 2 ] [ 6 ] [ 7 ]} En contraste, los métodos de preparación de bibliotecas de RNA-seq masivos, como el kit Illumina TruSeq mRNA Stranded, utilizan el cebado aleatorio de ARN prefragmentado para la transcripción inversa para asegurar que las lecturas se generen a lo largo de toda la longitud de los transcritos de ARNm. ^{[ 10 ]}

La síntesis de la segunda cadena se realiza en cada método mediante la traducción de muescas de la ADN polimerasa 1 o PCR, lo que da como resultado ADN complementario (ADNc) de doble cadena. A continuación, se lleva a cabo un proceso llamado tagmentación, en el que el ADNc de doble cadena se fragmenta y se marca utilizando la transposasa Tn5 , que corta el ADNc y liga adaptadores para la amplificación de la biblioteca. Algunos métodos utilizan cebadores aleatorios para esta etapa. ^{[ 2 ] [ 7 ]}

A continuación, se lleva a cabo la indexación de la biblioteca y la amplificación por PCR, lo que da como resultado bibliotecas enriquecidas con la región 3' no traducida de los ARNm y aptas para la secuenciación de lectura corta en instrumentos de secuenciación Illumina o MGI. ^{[ 2 ] [ 7 ] [ 6 ]}

Los métodos 3' mRNA-seq son generalmente más baratos por muestra que los métodos estándar de RNA-seq en masa. ^{[ 2 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Esto se debe a la menor profundidad de secuenciación requerida debido a que solo se secuencia el extremo 3' de las moléculas de ARNm en lugar de la longitud completa de los transcritos completos. Se recomiendan profundidades de lectura de entre un millón y cinco millones de lecturas en los protocolos comerciales de 3' mRNA-seq y son adecuados para detectar la mayoría de los genes altamente expresados. ^{[ 11 ] [ 12 ]} Esto también permite que se secuencien más muestras en la misma corrida de secuenciación. El rendimiento de muestras para la preparación de bibliotecas de 3' mRNA-seq difiere según el método, pero puede permitir que se procesen hasta 384 muestras en placas, con opciones para la automatización. ^{[ 2 ] [ 12 ]} Para los métodos donde las muestras se agrupan al principio del flujo de trabajo, el uso de consumibles y el costo se reducen aún más. Por ejemplo, BRB-seq es hasta 25 veces más barato que las preparaciones de bibliotecas de ARNm con hebras de Illumina TruSeq, con un costo equivalente al de evaluar cuatro genes mediante RT-qPCR. ^{[ 2 ]}

Los métodos son en gran medida insensibles a la degradación del ARN porque solo se prepara para la secuenciación la región 3' de los transcritos de ARNm, independientemente de cuán fragmentadas estén las demás moléculas de ARNm debido a la degradación. Esto hace que los métodos de secuenciación de ARNm 3' sean adecuados tanto para ARN de alta calidad como para ARN degradado con RIN <6 y dan como resultado datos de una calidad similar a los métodos de secuenciación de ARN de longitud completa. ^{[ 2 ]} Sin embargo, como solo se secuencia la región 3' de las moléculas de ARNm, los métodos de secuenciación de ARNm 3' no son adecuados para el análisis de transcritos de longitud completa, variantes de empalme, genes de fusión o edición de ARN.