microscopio 4Pi

Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . Con él, el rango típico de resolución axial de 500–700 nm se puede mejorar a 100–150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con un volumen 5–7 veces menor que el de la microscopía confocal estándar . ^{[ 1 ]}  

La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes objetivo opuestas, ambas enfocadas en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del camino óptico a través de cada una de las dos lentes objetivo se alinea cuidadosamente para que sea mínima. Mediante este método, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos pueden iluminarse coherentemente desde ambos lados y la luz reflejada o emitida también puede recolectarse coherentemente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido${\displaystyle \Omega }$La potencia utilizada para la iluminación y la detección aumenta y se aproxima a su máximo. En este caso, la muestra se ilumina y se detecta simultáneamente desde todos los lados.

En la figura se muestra el modo de funcionamiento de un microscopio 4Pi. La luz láser se divide mediante un divisor de haz y se dirige mediante espejos hacia los dos objetivos opuestos. En el punto focal común, se produce la superposición de ambos haces de luz enfocados. Las moléculas excitadas en esta posición emiten luz de fluorescencia, que es recogida por ambos objetivos, combinada por el mismo divisor de haz y desviada por un espejo dicroico hacia un detector. Allí, puede volver a producirse la superposición de ambas trayectorias de luz emitidas.

En el caso ideal, cada lente objetivo puede recoger luz desde un ángulo sólido de${\displaystyle \Omega =2\pi }$Con dos lentes objetivo se puede captar desde cualquier dirección (ángulo sólido).${\displaystyle \Omega =4\pi }$). El nombre de este tipo de microscopía deriva del ángulo sólido máximo posible para excitación y detección. En la práctica, solo se pueden lograr ángulos de apertura de unos 140° para una lente objetivo, lo que corresponde a${\displaystyle \Omega \approx 1.3\pi }$.

El microscopio puede funcionar de tres maneras diferentes: En un microscopio 4Pi de tipo A, se utiliza la superposición coherente de la luz de excitación para generar una mayor resolución. La luz de emisión se detecta desde un solo lado o mediante una superposición incoherente desde ambos lados. En un microscopio 4Pi de tipo B, solo interfiere la luz de emisión. Al operar en el modo de tipo C, se permite la interferencia tanto de la luz de excitación como de la de emisión, lo que produce el mayor aumento de resolución posible (aproximadamente 7 veces mayor a lo largo del eje óptico en comparación con la microscopía confocal).

En un microscopio 4Pi real, la luz no se puede aplicar ni recoger de forma uniforme desde todas las direcciones, lo que da lugar a los denominados lóbulos laterales en la función de dispersión puntual . Normalmente (aunque no siempre), en un microscopio 4Pi se utiliza la microscopía de excitación de dos fotones en combinación con un orificio de emisión para reducir estos lóbulos laterales a un nivel tolerable.

En 1971, Christoph Cremer y Thomas Cremer propusieron la creación de un holograma perfecto , es decir, uno que transporta toda la información de campo de la emisión de una fuente puntual en todas las direcciones, un llamado${\displaystyle 4\pi }$holograma. ^{[ 2 ] [ 3 ]} Sin embargo, la publicación de 1978 ^{[ 4 ]} había llegado a una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido. ^{[ 5 ]} La primera descripción de un sistema practicable de microscopía 4Pi, es decir, la configuración con dos lentes opuestas e interferentes, fue inventada por Stefan Hell en 1991. ^{[ 6 ]} Lo demostró experimentalmente en 1994. ^{[ 7 ]}

En los años siguientes, el número de aplicaciones de este microscopio aumentó. Por ejemplo, la excitación y detección paralelas con 64 puntos en la muestra simultáneamente, combinadas con la resolución espacial mejorada, permitieron registrar con éxito la dinámica de las mitocondrias en células de levadura con un microscopio 4Pi en 2002. ^{[ 8 ]} Leica Microsystems, fabricante de microscopios, lanzó una versión comercial en 2004 ^{[ 9 ]} que posteriormente fue descontinuada.

Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se lograba en combinación con técnicas de superresolución como el principio de agotamiento por emisión estimulada (STED). ^{[ 10 ]} Utilizando un microscopio 4Pi con haces de excitación y desexcitación adecuados, fue posible crear un  punto uniforme de 50 nm, lo que corresponde a un volumen focal reducido en comparación con la microscopía confocal en un factor de 150–200 en células fijas. Con la combinación de la microscopía 4Pi y la microscopía RESOLFT con proteínas conmutables, ahora es posible obtener imágenes de células vivas con bajos niveles de luz y resoluciones isotrópicas inferiores a 40  nm. ^{[ 11 ]}

• Microscopio de agotamiento por emisión estimulada (STED)
• Microscopía de plano multifocal (MUM)