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Proteómica basada en la actividad

Sonda basada en la actividad de fluorofosfonato - rodamina (FP-Rodamina) para el perfilado de la superfamilia de las serina hidrolasas . En esta sonda, el fluorofosfonato es el ...

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Sonda basada en la actividad de fluorofosfonato - rodamina (FP-Rodamina) para el perfilado de la superfamilia de las serina hidrolasas . En esta sonda, el fluorofosfonato es el grupo reactivo (GR), ya que se une irreversiblemente al nucleófilo de serina del sitio activo de las serina hidrolasas , y la etiqueta es la rodamina , un fluoróforo para la visualización en gel .

La proteómica basada en la actividad , o perfilado de proteínas basado en la actividad ( ABPP ), es una estrategia quimioproteómica que emplea sondas modulares para evaluar directamente el estado funcional de las enzimas dentro de proteomas complejos. [ 1 ] A diferencia de la proteómica basada en la expresión, que mide la abundancia de proteínas, la ABPP proporciona información sobre la actividad catalítica, lo que permite a los investigadores distinguir entre las formas activas e inactivas de las enzimas. Esta perspectiva funcional ha demostrado ser valiosa para identificar dianas farmacológicas, mapear sitios ligables y comprender la regulación enzimática en contextos fisiológicos y patológicos. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Al modificar covalentemente los sitios activos , las sondas basadas en la actividad ( ABP ) permiten el etiquetado selectivo, el enriquecimiento y el aislamiento de proteínas, reduciendo la complejidad de las muestras proteómicas y facilitando el análisis posterior. [ 6 ] La ABPP se ha aplicado en diversos sistemas biológicos, incluyendo células, tejidos y organismos completos, y ha contribuido a los avances en el descubrimiento de biomarcadores, el desarrollo de fármacos y la obtención de imágenes in vivo. [ 2 ] [ 7 ] [ 8 ]

Desarrollo histórico

Los primeros experimentos similares al perfilado basado en la actividad se llevaron a cabo en la década de 1970, cuando se utilizaron moléculas pequeñas para estudiar el mecanismo de acción del antibiótico modificador de serina penicilina . [ 9 ] La era moderna de ABPP comenzó en la década de 1990 con el desarrollo de ABP compatibles con flujos de trabajo proteómicos, y las primeras aplicaciones de ABPP se informaron durante esta década en estudios de proteasas. [ 10 ] [ 11 ] En 1999, el laboratorio de Cravatt introdujo formalmente el término "perfilado de proteínas basado en la actividad", estableciendo un marco para la proteómica funcional sistemática. [ 12 ] El trabajo posterior de Ben Cravatt en el Instituto de Investigación Scripps , Matthew Bogyo en la Universidad de Stanford y Herman S. Overkleeft en la Universidad de Leiden ayudó a definir el campo a través del diseño de sondas dirigidas a hidrolasas de serina , [ 12 ] proteasas de cisteína , [ 13 ] oxidorreductasas , [ 14 ] citocromo P450 humano [ 15 ] y otras familias de enzimas. Desde su inicio, ABPP se ha expandido rápidamente, con análisis bibliométricos que documentan un crecimiento exponencial en publicaciones y una adopción generalizada en América del Norte, Europa y Asia. [ 16 ] Los avances en espectrometría de masas y tecnologías de separación de proteínas aceleraron aún más la integración de ABPP en la investigación proteómica, lo que permitió la caracterización de la actividad enzimática a escala global y estableció a ABPP como una piedra angular de la proteómica funcional .

Diseño de sonda

La unidad básica de ABPP es la sonda basada en la actividad (ABP), que son sondas de molécula pequeña diseñadas para perfilar las actividades enzimáticas de una gama de enzimas relacionadas dentro de un proteoma complejo. Aunque las arquitecturas específicas varían, la mayoría de las ABP comparten tres componentes modulares: (1) un grupo reactivo (RG, a veces llamado "cabeza de guerra"), (2) un enlazador o elemento de unión y (3) una etiqueta utilizada para la detección o el enriquecimiento. Esta modularidad permite que las sondas logren una cobertura amplia pero mecanísticamente significativa de una clase de enzimas, al tiempo que minimizan la reactividad fuera del objetivo. [ 6 ]

Grupo reactivo

El grupo reactivo, a menudo denominado "cabeza de guerra", se une covalentemente a residuos conservados en los sitios activos de las enzimas . Es el determinante central de la selectividad enzimática. Media la unión covalente irreversible o fotoinducida a residuos ubicados en el sitio activo . En términos generales, estos se dividen en dos clases funcionales: cabezas de guerra electrófilas y cabezas de guerra fotorreactivas. Las cabezas de guerra electrófilas reaccionan con nucleófilos conservados , por ejemplo, los fluorofosfonatos se utilizan ampliamente para dirigirse a las serina hidrolasas , [ 12 ] mientras que los epóxidos y las vinil sulfonas se han aplicado a las cisteína proteasas [ 13 ].   Las cabezas de guerra fotorreactivas se utilizan cuando una clase de enzima carece de un nucleófilo catalítico , como en el caso de las metaloproteasas [ 17 ] o las histona deacetilasas . [ 18 ] Estas sondas incorporan fragmentos de benzofenona [ 19 ] o diazirina [ 20 ] que, tras la irradiación UV, producen intermedios radicales que forman enlaces cruzados covalentes con residuos cercanos en el sitio activo de la enzima .

Con clases de enzimas como las serina hidrolasas [ 12 ] y las metaloproteasas [ 17 ] que a menudo interactúan con inhibidores endógenos o que existen como zimógenos inactivos , ABPP ofrece una valiosa ventaja sobre las técnicas tradicionales que dependen de la abundancia en lugar de la actividad. Debido a que la actividad enzimática es necesaria para la interacción productiva con el grupo reactivo, los precursores inactivos y las formas enzimáticas unidas a inhibidores generalmente permanecen sin marcar. [ 21 ] Sin embargo, debido a que el entrecruzamiento fotoinducido no requiere recambio catalítico, las proteasas inactivas aún pueden ser marcadas, lo que reduce la dependencia intrínseca de la actividad de las sondas fotorreactivas. Esta limitación ha motivado la incorporación de grupos funcionales que mejoran la selectividad directamente en el diseño de la sonda. En el caso de las metaloproteasas , las enzimas activas coordinan un ion metálico catalítico. Al agregar una porción quelante de metales al andamiaje de la sonda, las ABP fotorreactivas pueden estar sesgadas hacia la forma catalíticamente competente, unida al metal, de la enzima, mejorando así la discriminación entre la forma activa e inactiva. [ 17 ] [ 20 ] Otro desafío importante en el diseño es lograr la reactividad suficiente para marcar la enzima deseada sin modificar indiscriminadamente proteínas no relacionadas. Se han desarrollado estrategias como las cabezas de guerra enmascaradas, que se activan solo en presencia de una enzima objetivo, para mejorar la especificidad. [ 22 ]

Enlazador

Entre el grupo reactivo y la etiqueta, las ABP suelen incluir un enlazador / espaciador / elemento de biorreconocimiento , que puede ajustar la solubilidad de la sonda, la accesibilidad estérica y la imitación del sustrato. Los enlazadores simples pueden consistir en cadenas alquílicas o espaciadores de polietilenglicol (PEG) que ajustan la hidrofobicidad y mejoran el marcaje en diversos proteomas . Los diseños más complejos incorporan elementos de biorreconocimiento que pueden conferir selectividad a familias o subfamilias de enzimas. Por ejemplo, se han utilizado fosfonatos que imitan el sustrato para dirigirse a proteasas de serina específicas [ 23 ] y las secuencias peptídicas optimizadas pueden discriminar isoformas de caspasas. [ 24 ] Los motivos de unión o de direccionamiento dentro del enlazador pueden mejorar aún más las interacciones con enzimas cuyos sitios activos imponen restricciones estructurales, mejorando así la especificidad de la sonda. [ 25 ] Además, la longitud y la composición del enlazador pueden modular la permeabilidad y la distribución de la sonda en contextos celulares o in vivo. Este componente permite a los diseñadores de sondas equilibrar la amplitud (perfilado de una clase completa de enzimas) con la especificidad (direccionamiento a miembros individuales).

Etiqueta

La etiqueta puede ser un reportero directo, como un fluoróforo , o una etiqueta de afinidad como la biotina , o puede consistir en un grupo latente como un alquino o una azida para su uso con la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen (también conocida como química click ). [ 26 ] Las etiquetas reporteras facilitan la detección y el aislamiento de proteínas marcadas. Ejemplos comunes incluyen fluoróforos utilizados para la visualización mediante fluorescencia en gel y cribados de alto rendimiento basados ​​en gel, biotina para el enriquecimiento basado en estreptavidina seguido de espectrometría de masas , y etiquetas isotópicas [ 27 ] [ 28 ] para espectrometría de masas cuantitativa. Alternativamente, los alquinos o las azidas pueden incorporarse como grupos bioortogonales para la conjugación posterior al marcaje mediante química click , lo que permite la adición modular de fluoróforos , etiquetas de afinidad o etiquetas isotópicas [ 27 ] [ 28 ] después del marcaje del proteoma. [ 26 ] [ 29 ] Estos diseños "clicables" minimizan el impedimento estérico en el sitio activo y amplían la flexibilidad analítica, particularmente para métodos de cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución .

Métodos de detección

ABPP en gel utilizando sondas con diferentes fluoróforos en la misma calle para perfilar simultáneamente las diferencias en las actividades enzimáticas.

El ABPP se puede analizar utilizando diversas estrategias de detección complementarias, cada una adecuada para diferentes contextos experimentales. Estos métodos generalmente visualizan o enriquecen el aducto enzima-sonda, lo que permite una evaluación cualitativa, una comparación cuantitativa o la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas .

Uno de los flujos de trabajo ABPP más antiguos y ampliamente utilizados emplea la visualización directa en geles SDS-PAGE . [ 12 ] Las sondas con marcadores fluorescentes (por ejemplo, rodamina) generan bandas distintivas que corresponden a las enzimas marcadas, lo que permite una evaluación rápida de la actividad en diferentes muestras o condiciones de tratamiento. Este enfoque se utiliza comúnmente para familias de enzimas amplias, como las serina hidrolasas [ 12 ] o las cisteína proteasas [ 13 ] , y es compatible con el cribado de alto rendimiento para inhibidores. Dado que la lectura se basa en la fluorescencia en el gel en lugar de la abundancia de proteínas, el ABPP basado en gel distingue fácilmente las especies enzimáticas activas de las inactivas.

Sin embargo, una limitación significativa de la detección basada en gel es la falta de capacidad de resolución, lo que impide la resolución e identificación de proteínas de baja abundancia. En los últimos años, ABPP se ha combinado con espectrometría de masas en tándem, lo que permite la identificación de cientos de enzimas activas a partir de una sola muestra. Esta técnica, conocida como ABPP-MudPIT (tecnología de identificación de proteínas multidimensional), es especialmente útil para perfilar la selectividad de los inhibidores, ya que la potencia de un inhibidor se puede probar frente a cientos de objetivos simultáneamente. [ 30 ] Para el análisis de todo el proteoma, los ABP que incorporan etiquetas de afinidad (por ejemplo, biotina ) o grupos funcionales ( azidas o alquinos ) permiten el enriquecimiento de enzimas marcadas antes de la identificación mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Después del marcaje covalente en células o lisados, los aductos enzima-sonda se capturan utilizando estreptavidina u otras matrices de afinidad, se lavan para eliminar las proteínas no marcadas y se digieren para la identificación de péptidos basada en MS. [ 31 ] Esta estrategia proporciona alta sensibilidad y profundidad de cobertura, lo que facilita el descubrimiento de nuevos objetivos enzimáticos, la detección de enzimas de baja abundancia y el análisis de familias de enzimas complejas.

Para comparar la actividad enzimática en diferentes condiciones biológicas, ABPP se puede integrar con tecnologías proteómicas cuantitativas para medir la actividad enzimática relativa en diferentes muestras. [ 32 ] Técnicas como SILAC ( Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture ) incorporan aminoácidos codificados con isótopos pesados ​​o ligeros en proteínas celulares, lo que facilita la comparación directa basada en MS de péptidos marcados con sondas de diferentes muestras. [ 33 ] TMT ( Tandem mass tagging ) que utiliza etiquetas de masa isobáricas permite multiplexar y cuantificar simultáneamente péptidos marcados de múltiples muestras. [ 34 ]   Estas estrategias se han aplicado ampliamente para evaluar la selectividad de los inhibidores covalentes y los cambios en la actividad enzimática en todo el genoma. isoTOP-ABPP (Isotope Tagging of Optimized Probes for Activity-Based Protein Profiling) [ 27 ] es un flujo de trabajo especializado que se desarrolló para abordar algunas de las limitaciones de ABPP convencional, incluyendo la baja especificidad, la sensibilidad limitada y la ausencia de ligandos químicos selectivos para muchas enzimas humanas. Este método utiliza isótopos estables en marcadores derivados de sondas para mejorar la sensibilidad y la selectividad de ABPP, al tiempo que permite la cuantificación precisa de las interacciones proteicas en muestras biológicas complejas.

Además, las sondas fluorescentes y de fotoafinidad pueden aplicarse in situ o in vivo para visualizar la actividad enzimática dentro de células, tejidos u organismos completos. Estos enfoques proporcionan información espacial sobre la función enzimática y se han utilizado para estudiar procesos como la actividad de las proteasas en modelos de cáncer e infección. Los diseños emergentes buscan permitir la obtención de imágenes no invasivas y en tiempo real de la actividad enzimática en sistemas vivos. [ 35 ]

Ventajas y limitaciones

Una ventaja importante de ABPP es la capacidad de monitorear directamente la disponibilidad del sitio activo de la enzima, en lugar de estar limitado a la abundancia de proteínas o ARNm. Los ABP ideales se dirigirían a un número grande, pero manejable, de enzimas (de decenas a cientos) para brindar a los investigadores una visión global del estado funcional del proteoma. [ 6 ] Este grado de promiscuidad de diana debe equilibrarse con una reactividad cruzada mínima con proteínas no relacionadas. La mayoría de los ABP logran esta combinación de cobertura intraclase y reactividad extraclase limitada al acoplar grupos reactivos apropiados con elementos de unión que reconocen características mecanísticas o estructurales conservadas dentro de los sitios activos de las enzimas. Además, ABPP podría usarse para dirigirse a proteínas específicas que antes se consideraban dianas no farmacológicas. [ 36 ]

Una desventaja de los ABP es que su diseño está algo restringido por la necesidad de unir un electrófilo o un reticulante fotoinducido, lo que puede limitar la diversidad química. Otro posible inconveniente es que la modificación covalente del sitio activo inhibe irreversiblemente la enzima diana. Sin embargo, en muchos casos es posible utilizar concentraciones de ABP tales que solo una pequeña fracción del conjunto de enzimas activas esté marcada, minimizando así la alteración de la actividad enzimática general. [ 37 ] [ 38 ]

Véase también

Referencias

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