Adenililación

La AMPilación está implicada en la homeostasis bacteriana. El ejemplo más conocido es la AMPiladora GS-ATasa (GlnE), que contribuye a la compleja regulación del metabolismo del nitrógeno mediante la AMPilación de la glutamina sintetasa, tema que se trató en las secciones de AMPilación y DeAMPilación.

Otro ejemplo de AMPiladores que desempeñan un papel en la homeostasis bacteriana son los AMPiladores Fic de clase I (FicT), que modifican la subunidad GyrB de la ADN girasa, el residuo de tirosina conservado para la unión de ATP de la subunidad ParE en la topoisomerasa IV. Esta inactivación de la ADN girasa por AMPilación conduce a la activación de la respuesta SOS, que es la respuesta celular al daño del ADN. La actividad de la AMPilación de FicT es reversible y solo provoca la detención del crecimiento, pero no la muerte celular. Por lo tanto, la AMPilación de FicT desempeña un papel en la regulación del estrés celular, como se ha demostrado en la bacteria Wolbachia, donde el nivel de FicT aumenta en respuesta a la doxiciclina.

También se ha descubierto que el AMPilador Fic de clase III NmFic de N. meningtidis modifica el AMPilador GyrB en la tirosina conservada para la unión de ATP. Esto demuestra que los dominios Fic están altamente conservados, lo que indica el importante papel de la AMPilación en la regulación del estrés celular en bacterias. La regulación de NmFic implica la monomerización dependiente de la concentración y la autoAMPilación para la activación de la actividad de NmFic. ^{[ 5 ]}

Se ha demostrado que las proteínas bacterianas, también conocidas como efectores, utilizan la AMPilación. Se ha observado que efectores como VopS, IbpA y DrrA AMPilan las GTPasas del huésped y provocan cambios en el citoesqueleto de actina. Las GTPasas son dianas comunes de los AMPiladores. Las familias de GTPasas Rho , Rab y Arf participan en la dinámica del citoesqueleto de actina y el tráfico vesicular. También desempeñan funciones en mecanismos de control celular, como la fagocitosis en la célula huésped.

El patógeno mejora o previene su internalización induciendo o inhibiendo la fagocitosis de la célula huésped ^{[ 4 ]} . Vibrio parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativa que causa intoxicación alimentaria como resultado del consumo de mariscos crudos o poco cocidos en humanos. ^{[ 9 ]} VopS, un efector de tipo III que se encuentra en Vibrio parahaemolyticus , contiene un dominio Fic que tiene un motivo HPFx(D/E)GN(G/K)R conservado que contiene un residuo de histidina esencial para la AMPilación. VopS bloquea el ensamblaje de actina modificando el residuo de treonina en la región switch 1 de las GTPasas Rho. La transferencia de una fracción AMP usando ATP al residuo de treonina produce un impedimento estérico y, por lo tanto, impide que las GTPasas Rho interactúen con los efectores posteriores. VopS también adenila RhoA y el ciclo de división celular 42 (CDC42), lo que lleva a una desagregación de la red de filamentos de actina. ^{[ 3 ] [ 5 ]} Como resultado, el control del citoesqueleto de actina de la célula huésped se desactiva, lo que conduce al redondeamiento celular. ^{[ 4 ] [ 9 ]}

IbpA es secretada en células eucariotas por H. somni , una bacteria Gram-negativa en el ganado que causa infección del epitelio respiratorio. Este efector contiene dos dominios Fic en la región C-terminal. La AMPilación del dominio Fic de IbpA de las GTPasas de la familia Rho es responsable de su citotoxicidad. Ambos dominios Fic tienen efectos similares en el citoesqueleto de las células huésped como VopS. ^{[ 3 ] [ 5 ]} La AMPilación en un residuo de tirosina de la región switch 1 bloquea la interacción de las GTPasas con sustratos posteriores como PAK.

DrrA es el sustrato del sistema de translocación tipo IV Dot/Icm de Legionella pneumophila . Es el efector secretado por L. pneumophila para modificar las GTPasas de las células huésped. Esta modificación aumenta la supervivencia de las bacterias en las células huésped. DrrA está compuesto por un dominio de factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) específico de Rab1b , un dominio de unión a lípidos C-terminal y un dominio N-terminal con propiedades citotóxicas aún no del todo claras. Estudios demuestran que tanto el dominio N-terminal como la proteína DrrA completa presentan actividad AMPiladora sobre la proteína Rab1b del huésped (proteína relacionada con Ras), que también es sustrato del dominio GEF de Rab1b. La proteína Rab1b es la GTPasa Rab que regula el transporte de vesículas y la fusión de membranas. La adenilación por AMPiladores bacterianos prolonga el estado unido a GTP de Rab1b. Por lo tanto, la función del efector DrrA está relacionada con los beneficios que las vacuolas bacterianas aportan a su replicación durante la infección. ^{[ 3 ] [ 5 ]}

El descubrimiento de una AMPilasa en células animales ^{[ 10 ]} , seguido del descubrimiento de su localización en el RE y de que BiP es un sustrato importante para su actividad ^{[ 12 ], fueron} avances significativos. Se sabía desde hacía tiempo que BiP (también conocido como Grp78) sufría una modificación postraduccional inactivadora ^{[ 13 , 14 ]} , pero su naturaleza seguía siendo desconocida. Si bien se asumía ampliamente que se trataba de ADP-ribosilación , resultó ser una AMPilación mediada por FICD, ya que la inactivación del gen FICD en las células eliminó toda modificación postraduccional medible de BiP ^{[ 15 ] .}

BiP es una proteína chaperona localizada en el RE cuya actividad está estrictamente regulada a nivel transcripcional mediante un programa de expresión génica conocido como Respuesta a Proteínas Desplegadas (UPR). La UPR es un proceso homeostático que acopla la tasa de transcripción de BiP (y de muchas otras proteínas) a la carga de proteínas desplegadas en el RE (el llamado estrés del RE) para ayudar a mantener la proteostasis del RE . La AMPilación añade otra capa rápida de control postraduccional de la actividad de BiP, ya que la modificación de la treonina 518 del dominio de unión al sustrato de BiP con un AMP bloquea la chaperona en una conformación inactiva. ^{[ 16 ] [ 17 ]} Esta modificación se despliega selectivamente cuando el estrés del RE disminuye, para inactivar el exceso de BiP. Sin embargo, cuando el estrés del RE vuelve a aumentar, la misma enzima, FICD, cataliza la reacción opuesta, la des-AMPilación de BiP. ^{[ 8 ]}

Está surgiendo gradualmente una comprensión de la base estructural de la AMPilación y desAMPilación de BiP, ^{[ 18 ] [ 19 ]} así como pistas sobre la alostería que podría regular el cambio en la actividad de FICD ^{[ 20 ]} pero aún quedan por descubrir detalles importantes de este proceso tal como ocurre en las células.

El papel de FICD en la AMPilación (y desAMPilación) de BiP en Thr518 está bien respaldado por estudios bioquímicos y estructurales. También se ha presentado evidencia de que, en algunas circunstancias, FICD puede AMPilar un residuo diferente, Thr366, en el dominio de unión de nucleótidos de BiP. ^{[ 12 ]}

Fic-1 es la única proteína Fic presente en el código genético de C. elegans . Se encuentra principalmente en la envoltura nuclear del RE de las células germinales adultas y las células embrionarias, aunque también puede encontrarse en pequeñas cantidades en el citoplasma. A esta reserva extrarreticular de FICD-1 se le atribuye la AMPilación de las histonas centrales y los factores de traducción de tipo eEF1-A en el nematodo. ^{[ 21 ]}

Aunque los distintos niveles de AMPilación no produjeron efectos perceptibles en el comportamiento o la fisiología del nematodo, los gusanos con deficiencia de Fic-1 fueron más susceptibles a la infección por Pseudomonas aeruginosa en comparación con sus homólogos con dominios Fic-1 activos, lo que implica una relación entre la AMPilación de dianas celulares y las respuestas inmunitarias en los nematodos. ^{[ 11 ]}

Las moscas que carecen de FICD (CG9523) han sido descritas como ciegas. Inicialmente, este defecto se atribuyó a una función de FICD en la superficie celular de las proyecciones capitadas, un sitio putativo de reciclaje de neurotransmisores ^{[ 22 ]} , sin embargo, un estudio posterior implicó la AMPilación de BiP Thr366 mediada por FICD en el problema visual ^{[ 23 ].}

Se utilizan marcadores químicos para detectar proteínas modificadas postraduccionalmente. Recientemente, se ha desarrollado un N6pATP que contiene una etiqueta alquinilo (propargilo) en la posición N6 de la adenina del ATP. Este N6pATP se combina con la reacción de clic para detectar proteínas AMPiladas. Para detectar proteínas modificadas no reconocidas y marcar sustratos de VopS, se utilizan derivados de ATP con un fluoróforo en el grupo NH2 de la adenina N6. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

Los anticuerpos son conocidos por su alta afinidad y selectividad, lo que los convierte en una buena manera de detectar proteínas AMPiladas. Recientemente, se desarrollaron anticuerpos α-AMP para detectar y aislar directamente proteínas AMPiladas (especialmente tirosina AMPilada y treonina AMPilada) de células y lisados ​​celulares. ^{[ 25 ]} La AMPilación es una modificación postraduccional que se puede encontrar en muchas secuencias de proteínas. Por lo tanto, en lugar de usar anticuerpos que detecten una secuencia peptídica AMPilada específica, se considera superior generar anticuerpos AMP dirigidos directamente a aminoácidos específicos. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

Anteriormente, muchos estudios utilizaron espectrometría de masas (EM) en diferentes modos de fragmentación para detectar péptidos AMPilados. En respuesta a las distintas técnicas de fragmentación, las secuencias de proteínas AMPiladas se desintegraron en diferentes partes del AMP. Mientras que la disociación por transferencia de electrones (ETD) crea fragmentos mínimos y espectros menos complejos, la disociación inducida por colisión (CID) y la fragmentación por colisión de alta energía (HCD) generan iones característicos adecuados para la identificación de proteínas AMPiladas mediante la generación de múltiples fragmentos de AMP. Debido a la estabilidad del AMP, los espectros de fragmentación de péptidos son fáciles de leer manualmente o con motores de búsqueda. ^{[ 5 ] [ 6 ]}