Hispanopedia WikiLa lisis alcalina es el proceso de aislar y extraer ácido desoxirribonucleico (ADN) de plásmidos y otras fuentes extracromosómicas presentes en células como las bacterianas. Es un método estándar utilizado en biología molecular para aislar ADN plasmídico sin obtener ADN cromosómico o genómico . La primera lisis alcalina fue realizada por Birnom y Doly en 1979. [ 1 ] Existen muchas variaciones del procedimiento, pero el proceso general de lisis alcalina se puede resumir en los siguientes pasos: formación de un precipitado celular, resuspensión del precipitado en solución, lisis celular , neutralización y centrifugación . [ 2 ] La lisis alcalina aprovecha la composición física pequeña y superenrollada del ADN plasmídico en comparación con el ADN cromosómico, junto con su capacidad para reasociar el ADN de doble cadena en condiciones óptimas. Esto permite la separación del ADN plasmídico del ADN cromosómico y otros componentes celulares.
Método
La lisis alcalina suele ser un paso inicial en los experimentos de biología molecular, ya que permite extraer y purificar moléculas de ADN específicas para su posterior uso en aplicaciones posteriores. Cuando se realiza correctamente, la lisis alcalina produce ADN puro exclusivamente a partir de plásmidos bacterianos. Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que se encuentra de forma natural en ciertos tipos de células, principalmente en bacterias, y se replica independientemente del ADN cromosómico o genómico de la célula. Los plásmidos también se pueden encontrar, con menor frecuencia, en células arqueanas y eucariotas . A menudo contienen información genética útil para la célula huésped, como genes que confieren resistencia a antibióticos o factores de virulencia . Las células bacterianas absorben fácilmente los plásmidos del medio ambiente y pueden transmitirse entre células mediante diversas formas de transmisión horizontal, como la transducción , la transformación y la conjugación , así como mediante transmisión vertical de progenitores a descendientes. Debido a su versatilidad y manipulación relativamente sencilla, los plásmidos son de interés para los científicos y se han convertido en una herramienta de laboratorio estandarizada para introducir artificialmente ADN recombinante en células y genomas.
El proceso básico de lisis alcalina implica una serie de pasos que pueden realizarse en el laboratorio:
Paso 1: Formación del sedimento celular
En primer lugar, se centrifuga una muestra que contiene células bacterianas, generalmente cultivadas in vitro , para formar un sedimento celular en el fondo del tubo. La centrifugación permite separar las células bacterianas del medio de cultivo y de cualquier otro residuo presente en la muestra. El sobrenadante se desecha, dejando únicamente el sedimento celular en el fondo del tubo.
Paso 2: Resuspensión
El precipitado se resuspende en una solución tampón que contiene EDTA , Tris-HCl , glucosa y ribonucleasas . El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un agente quelante que se une a iones metálicos, principalmente iones divalentes o trivalentes. En este paso, se agrega EDTA para unirse a los iones de calcio y magnesio, que se encuentran naturalmente en las células y son utilizados por las enzimas DNasa para cortar el ADN de doble cadena; secuestrándolos con EDTA, por lo tanto, evita que las DNasas degraden el ADN plasmídico. El hidrocloruro de Tris es una solución tampón ampliamente utilizada que estabiliza el pH y, por lo tanto, protege la integridad del ADN. [ 3 ] El Tris-HCl es necesario debido al entorno de pH alto (alcalino) que debe establecerse temporalmente para lisar las células y liberar su contenido. La glucosa es un osmolito , una molécula que ayuda a regular el estrés osmótico ; Se añade para evitar la lisis celular incontrolada y, por consiguiente, el daño al ADN. Las ARNasas son enzimas que degradan las moléculas de ARN, impidiendo la contaminación del ADN plasmídico con cualquier molécula de ARN presente en las células.
Paso 3: Lisis celular
El dodecilsulfato de sodio (SDS) y el hidróxido de sodio (NaOH) se utilizan para lisar las células. El hidróxido de sodio es una base fuerte que aumenta drásticamente el pH de la solución, creando un ambiente alcalino que altera las bicapas de fosfolípidos que componen las membranas celulares y rompe los enlaces de hidrógeno entre las hebras apareadas del ADN cromosómico de doble cadena, convirtiéndolo en monocatenario. Aunque el ADN plasmídico también es de doble cadena y se disocia en hebras simples, su naturaleza altamente superenrollada impide que las hebras individuales se separen en la solución, permitiendo que se vuelvan a unir posteriormente. El dodecilsulfato de sodio es un surfactante aniónico que se inserta en la bicapa de fosfolípidos, alterando las interacciones hidrofóbicas que conforman las membranas celulares. De esta manera, el hidróxido de sodio y el detergente SDS actúan conjuntamente para lisar las células huésped y liberar su contenido interno, incluyendo moléculas de ADN cromosómico y plasmídico, en la solución.
Paso 4: Neutralización
Una propiedad del ADN es su capacidad de volver a unirse en moléculas de doble cadena cuando se neutraliza el pH. En condiciones neutras, se reforman los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias. Debido a que el plásmido estaba muy enrollado y era pequeño antes de que se establecieran las condiciones alcalinas, puede volver a unirse fácilmente. Sin embargo, el ADN cromosómico, debido a sus largas cadenas, no se vuelve a unir. [ 1 ]
Paso 5: Centrifugación
Una vez que el ADN plasmídico se reasocia en moléculas de doble cadena, se disuelve en la solución. El acetato de potasio reacciona con el detergente SDS, los iones de magnesio y los iones de calcio ya presentes en la solución y forma dodecilsulfato de potasio (KDS), un sólido blanco insoluble que precipita . [ 4 ] Las cadenas restantes de ADN cromosómico, las proteínas desnaturalizadas y los químicos añadidos se adhieren y precipitan con el KDS. Sin embargo, el ADN plasmídico permanece disuelto en la solución líquida. La solución se centrifuga habitualmente para recoger los precipitados insolubles en un sedimento en el fondo del tubo de muestra y así aislarlos del sobrenadante.
productos químicos
- dodecilsulfato de sodio (SDS)
- hidróxido de sodio
- Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
- Clorhidrato de tris (HCl)
- Glucosa
- Acetato de potasio
Aplicaciones
La transformación implica el uso de enzimas de restricción para cortar plásmidos en ubicaciones específicas y permitir la inserción de un gen de interés. El plásmido recombinante se introduce en una célula bacteriana, donde puede replicarse de forma independiente, lo que permite a la bacteria expresar el gen de interés. Estos plásmidos pueden utilizarse para clonar genes o modificar su expresión.
La producción de proteínas recombinantes es un proceso de transformación celular mediante ADN recombinante que codifica una proteína específica. Una vez introducido el plásmido recombinante en la célula huésped, esta produce la proteína. Este proceso se utiliza comúnmente en el campo de la medicina para la producción de insulina, hormonas y factores de crecimiento.
La terapia génica consiste en la modificación de los genes de un individuo para tratar una enfermedad o trastorno. La terapia génica mediante plásmidos es una opción de tratamiento potencial para personas con un gen disfuncional que causa un trastorno. El ADN recombinante de una copia funcional del gen defectuoso puede incorporarse a una célula huésped que contiene un plásmido. Esto proporciona a la célula huésped un gen funcional para tratar el trastorno. [ 5 ]
Las vacunas de ADN son un tipo de vacuna que utiliza ADN plasmídico para desencadenar una respuesta inmunitaria en el organismo. [ 6 ] El ADN plasmídico codifica un antígeno que el sistema inmunitario detecta como extraño. El sistema inmunitario lleva a cabo una respuesta inmunitaria que genera inmunidad. Si el virus para el que se creó la vacuna entra en el organismo, el sistema inmunitario sabrá cómo atacarlo. La vacuna de ADN puede personalizarse para el virus específico basándose en el ADN recombinante plasmídico.
Referencias
- 1 2 Birnboim, HC; Doly, J. (1979-11-24). "Un procedimiento rápido de extracción alcalina para la detección de ADN plasmídico recombinante" . Nucleic Acids Research . 7 (6): 1513– 1523. doi : 10.1093/nar/7.6.1513 . ISSN 1362-4962 . PMC 342324. PMID 388356 .
- ↑ IslandPubDev518 (07-06-2021). "Método de lisis alcalina: cómo funciona en 5 sencillos pasos" . bitesizebio.com . Consultado el 03-12-2024 .
{{cite web}}: CS1 maint: nombres numéricos: lista de autores ( enlace ) - ↑ Bivehed, Erik; Hellman, Björn; Fan, Yuting; Haglöf, Jakob; Buratovic, Sonja (2023-10-01). "Integridad del ADN en condiciones alcalinas: una investigación de los factores que afectan el ensayo cometa" . Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis . 891 503680. Bibcode : 2023MRGTE.89103680B . doi : 10.1016/j.mrgentox.2023.503680 . ISSN 1383-5718 . PMID 37770137 .
- ↑ "Método de lisis alcalina para la purificación de plásmidos bacterianos | QIAGEN" . www.qiagen.com . Consultado el 3 de diciembre de 2024 .
- ↑ "Investigación en terapia celular y génica | ADN plasmídico y lentivirus" . Consultado el 3 de diciembre de 2024 .
- ↑ Tregoning, John S.; Kinnear, Ekaterina (21-11-2014). Tolmasky, Marcelo; Alonso, Juan Carlos (eds.). "Uso de plásmidos como vacunas de ADN para enfermedades infecciosas" . Microbiology Spectrum . 2 (6) 2.6.21. doi : 10.1128/microbiolspec.PLAS-0028-2014 . ISSN 2165-0497 . PMID 26104452 .
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