Flora de Schaedler alterada

La flora de Schaedler alterada (ASF) es una comunidad de ocho especies bacterianas : dos lactobacilos , un Bacteroides , una bacteria espiral del género Flexistipes y cuatro especies fusiformes extremadamente sensibles al oxígeno (EOS). ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} Las bacterias se seleccionan por su predominio y persistencia en la microflora normal de los ratones , y por su capacidad de ser aisladas y cultivadas en entornos de laboratorio. Animales libres de gérmenes , principalmente ratones, son colonizados con ASF con el propósito de estudiar el tracto gastrointestinal (GI) . Las bacterias mutualistas intestinales juegan un papel importante en la afectación de la expresión génica del tracto GI, las respuestas inmunes , la absorción de nutrientes y la resistencia a patógenos . ^{[ 4 ]} El cóctel microbiano estandarizado permitió el estudio controlado de las interacciones microbio-huésped, el papel de los microbios, los efectos de los patógenos y la inmunidad intestinal y la asociación con enfermedades, como el cáncer , la enfermedad inflamatoria intestinal , la diabetes y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes . Además, en comparación con los animales libres de gérmenes, los ratones ASF tienen un sistema inmunitario completamente desarrollado, resistencia a patógenos oportunistas y una función y salud gastrointestinal normales, y son una excelente representación de ratones normales. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 5 ]}

El tracto gastrointestinal es particularmente difícil de estudiar debido a su compleja interacción huésped-patógeno. Con 10⁷ ^- 10¹¹ ^bacterias , más de 400 especies y variaciones entre individuos, existen muchas complicaciones en el estudio de un sistema gastrointestinal normal. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Por ejemplo, es problemático asignar una función biológica a microbios específicos y a la estructura de la comunidad, e investigar las respuestas inmunitarias respectivas. Además, el microbioma variable de los ratones debe estar bajo condiciones controladas para la repetición de los experimentos. Los ratones libres de gérmenes y los ratones libres de patógenos específicos (SPF) son útiles para abordar algunos de los problemas, pero inadecuados en muchas áreas. Los ratones libres de gérmenes no son una buena representación de los ratones normales, con problemas como ciego agrandado , bajas tasas de reproducción, sistema inmunitario poco desarrollado y salud reducida. Los ratones SPF aún contienen una microbiota variable, solo que sin ciertas especies de patógenos conocidas. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 5 ]} Existe una necesidad en el campo científico de una mezcla bacteriana conocida que sea necesaria y suficiente para ratones sanos.

A mediados de la década de 1960, Russell W. Schaedler, MD, aisló y cultivó bacterias de ratones de laboratorio convencionales y SPF. ^{[ 3 ]} Las bacterias aerobias y anaerobias menos sensibles al oxígeno son fáciles de cultivar . Los anaerobios fusiformes y otras bacterias EOS son mucho más difíciles de cultivar, aunque representan la mayoría de la microbiota normal de los roedores. Seleccionó las bacterias que predominaban y podían aislarse en cultivo, y luego colonizó ratones libres de gérmenes con diferentes combinaciones de bacterias. Por ejemplo, una combinación podría incluir Escherichia coli , Streptococcus fecalis , Lactobacillus acidophilus , L. salivarius , Bacteroides distasonis y una especie de Clostridium spp. fusiforme EOS . ^{[ 3 ]} Cierta microflora definida es capaz de restaurar a los ratones libres de gérmenes para que se asemejen a los ratones normales con un volumen cecal reducido, capacidad reproductiva restaurada, resistencia a la colonización y un sistema inmunitario bien desarrollado. La denominada flora de Schaedler, las combinaciones de microflora definidas, se utilizaron ampliamente en estudios gnotobióticos . ^{[ 2 ] [ 5 ]}

En 1978, el Instituto Nacional del Cáncer solicitó a Roger Orcutt de Charles River Laboratories, cuyo mentor de doctorado fue el Dr. Schaedler, que revisara una nueva microflora para estandarizar todas sus reservas nucleares mantenidas en aisladores y cepas de ratones. ^{[ 3 ]} En lo que se denominó "flora de Schaedler alterada", se conservaron cuatro bacterias de la mezcla original de la microflora original del "cóctel de Schaedler": los dos Lactobacilli, el Bacteroides y la bacteria fusiforme EOS. Se añadieron cuatro bacterias más de los aislados del microbioma: una bacteria con forma de espiroqueta y tres nuevas bacterias fusiformes EOS. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 5 ]} Debido a la tecnología limitada de la época, no se conocía mucho sobre el género y la especie bacteriana específicos. Estas bacterias son persistentes y dominantes en los tractos gastrointestinales de ratones normales y SPF. La confirmación de la presencia correcta de la microbiota se limitó a observar la morfología celular (biología) , los rasgos bioquímicos y las características de crecimiento ^{[ 3 ].}

El Dr. Orcutt lamentó no haber incluido la bacteria filamentosa segmentada del intestino delgado de los ratones en la flora de Schaedler alterada, que está tan íntimamente ligada al sistema inmunitario del huésped, si hubiera podido cultivarla in vitro. Sin embargo, hasta el día de hoy, más de 40 años después, solo se puede mantener in vivo y resulta imposible aislarla en cultivo puro.

Con el reciente avance en biotecnología , los investigadores pudieron determinar el género y especie precisos de las bacterias ASF utilizando el análisis de secuencia del ARNr 16S . Las cepas identificadas son diferentes de las identidades presuntivas. ^{[ 3 ]} La distribución de las especies bacterianas en el intestino depende de su necesidad y aversión al oxígeno, la tasa de flujo y la abundancia de sustrato, con variabilidad basada en la edad, el sexo y otros microorganismos presentes en los ratones. ^{[ 6 ]} ASF 360 y ASF 361 son Lactobacilos. Los Lactobacilos son bacterias con forma de bastón, Gram positivas , aerotolerantes y colonizadores comunes del epitelio escamoso del estómago de los ratones. ^{[ 3 ]} Se pensó que ASF 360 era L. acidophilus . Sin embargo, los resultados del ARNr 16S mostraron que está estrechamente relacionado con L. acidophilus , pero es distinto de este. ASF 360 es una nueva especie de lactobacillus; Agrupado con L. acidophilus y L. lactis . ASF 361 tiene secuencias de ARNr 16S casi idénticas a las de L. murinus y L. animalis . Ambas especies se encuentran habitualmente en el tracto gastrointestinal de ratones y ratas. Es necesario un examen exhaustivo de las dos especies y cepas para determinar con mayor certeza la identidad de ASF 361. ASF 361 es completamente distinto de L. salivarius , que se creía que era. ASF 360 y ASF 361 colonizan en gran número el estómago y luego se desprenden y viajan a través del intestino delgado y el ciego. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 6 ]}

ASF 519 está relacionado con B. distasonis , la especie con la que se confundió antes de que estuviera disponible la secuenciación del ARN 16S. Sin embargo, al igual que las bacterias anteriores, es una especie distinta según la evidencia del ARN ribosómico 16S. Las especies de Bacteroides se encuentran frecuentemente en el tracto gastrointestinal de los mamíferos e incluyen bacterias gramnegativas , anaerobias , inmóviles y con forma de bacilo. Recientemente, se ha reconocido que muchas especies de Bacteroides pertenecen en realidad a otros géneros, como Porphyromonas y Prevotella. En el caso de ASF 519, pertenece al género Parabacteroides, recientemente denominado, junto con las bacterias anteriormente conocidas como [B.] distasonis, [B.] merdae , grupo CDC DF-3 y [B.] forsythus . ^{[ 3 ]}

La bacteria anaerobia obligada con forma espiral ASF 457 se encuentra en pequeñas cantidades en el intestino delgado y en alta concentración en el intestino grueso. Esta bacteria está relacionada con G. ferrireducens, Deferribacter thermophilus y Flexistipes sinusarabici . Posteriormente, ASF 457 recibió el nombre de Mucispirillum schaedleri . La especie está relacionada con el filo Flexistipes, que incluye aislados ambientales reductores de hierro. ^{[ 3 ]}

Las bacterias fusiformes EOS constituyen la gran mayoría de la microbiota intestinal autóctona y se encuentran principalmente en el intestino grueso. Superan ampliamente en número a las bacterias anaerobias facultativas y aerobias. ^{[ 6 ]} Los cuatro anaerobios fusiformes pertenecen al grupo de bacterias Gram positivas con bajo contenido de G+C. ASF 356 es del género Clostridium, estrechamente relacionado con Clostridium propionicum . ASF 502 está más relacionado con Ruminococcus gnavus . ASF 492 se confirma mediante secuencias de ARNr 16S como Eubacterium plexicaudatum y está estrechamente relacionado con Roseburia ceciola . ASF 356, ASF 492 y ASF 502 son todos parte de las bacterias Gram positivas con bajo contenido de G+C del clúster XIV de Clostridium. ASF 500 es una rama más profunda dentro de las bacterias Gram positivas con bajo contenido de G+C de Firmicutes, grupo Bacillus-Clostridium, pero no se puede encontrar mucho en la base de datos GenBank sobre esta rama del clúster Clostridium ^{[ 2 ] [ 3 ].}

Solo se han colonizado ratones con ASF en experimentos, ya que las bacterias ASF se originan en el microbioma intestinal de los ratones. Los ratones libres de gérmenes se colonizan con ASF mediante uno de dos métodos. Se puede cultivar un cultivo puro de cada bacteria ASF viva en condiciones anaeróbicas en un entorno de laboratorio. Primero se administran lactobacilos y bacteroides por sonda gástrica a ratones libres de gérmenes para establecer un ambiente microbiano en el tracto gastrointestinal, que luego favorece la colonización de las bacterias espirales y fusiformes que se administran posteriormente. Una forma alternativa es inocular el agua de bebida de ratones libres de gérmenes con heces frescas del ciego y el colon de ratones gnotobióticos (ratones ASF), durante un período de cuatro días. ^{[ 2 ] [ 5 ] [ 7 ]} El establecimiento y la concentración de cada especie bacteriana varían ligeramente dependiendo de la edad, el sexo y las condiciones ambientales de los ratones. ^{[ 8 ]}

Los resultados experimentales validan el dominio y la persistencia de la ASF en los ratones colonizados incluso después de cuatro generaciones. ^{[ 7 ]} Los ratones pueden ser tratados con los mismos estándares que los ratones libres de gérmenes, como agua esterilizada, ambiente libre de gérmenes y manipulación cuidadosa. Aunque esto asegura la propagación definitiva de la ASF en el intestino de los ratones, es laborioso y no representa bien las condiciones fisiológicas. Los ratones ASF también pueden criarse en las mismas condiciones que los ratones normales, porque han abordado las debilidades inmunológicas, patológicas y fisiológicas de los ratones libres de gérmenes. ^{[ 2 ] [ 5 ]} Los ratones ASF pueden mantener las ocho especies de bacterias en condiciones normales. Sin embargo, con el tiempo podrían ocurrir variaciones en las cepas de las bacterias y la introducción de pequeñas cantidades de otros microbios comensales, mutualistas o patógenos. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Los ratones isogénicos que cohabitan mostraron poca variación en el perfil de ASF, mientras que la división de la camada en diferentes jaulas mostró divergencia en las cepas bacterianas. Una vez establecida la comunidad ASF, es muy estable a lo largo del tiempo sin perturbaciones ambientales o de vivienda ^{[ 8 ] [ 9 ].}

La ASF puede utilizarse para estudiar diversas actividades relacionadas con el tracto intestinal. Esto incluye el estudio de la comunidad microbiana intestinal, el metabolismo , la inmunidad, la homeostasis , la patogénesis , la inflamación y las enfermedades. Los experimentos que comparan ratones libres de gérmenes, ASF e infectados con patógenos pueden demostrar el papel de los comensales en el mantenimiento de la salud del huésped.

La homeostasis intestinal se mantiene mediante las interacciones huésped-microbio y la inmunidad del huésped. Esto es fundamental para la digestión de los alimentos y la protección contra patógenos. Bouskra et al. estudiaron la regulación de la flora intestinal y el sistema inmunitario. Encontraron células B productoras de IgA en las placas de Peyer, los tejidos y folículos linfoides intestinales y los ganglios linfáticos mesentéricos. Utilizaron ASF para evaluar la maduración de los folículos linfoides en grandes cúmulos de células B mediante la señalización del receptor tipo Toll. ^{[ 10 ]} En otro estudio, el sistema de detección innato genera un sistema inmunitario adaptativo para mantener la homeostasis intestinal. Geuking et al. examinaron el papel de las células T reguladoras en la limitación de la inflamación intestinal desencadenada por microbios y el compartimento de células T. Utilizando ASF, encontraron que la colonización intestinal resultó en la activación y generación de células Treg colónicas. En ratones libres de gérmenes, predominan las respuestas Th17 y Th1. ^{[ 11 ]}

El microambiente bacteriano es muy importante en la patogénesis de la inflamación intestinal crónica clínica y experimental. Whary, et al. examinaron la infección por Helicobacter rodentium y la tiflocolitis ulcerativa , la sepsis y la morbilidad resultantes . Utilizando ratones ASF, mostraron una disminución en la progresión de la enfermedad debido a la resistencia a la colonización en el intestino inferior por los impactos de la flora anaeróbica normal. ^{[ 12 ]} En otro resumen, Fox examinó la relación entre el microbioma del intestino y el inicio de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) con la infección por H. bilis. Se ha observado que H. bilis provoca una respuesta inmune heteróloga a la flora del intestino inferior, tanto en la activación de citocinas proinflamatorias y actividad de células dendríticas como en la actividad antiinflamatoria probiótica debido a la presentación de antígenos mutualistas. Los lactobacilos y bacteroides ASF ayudan a moderar la inflamación intestinal de manera equilibrada en estudios de infección por patógenos. ^{[ 13 ]} Más allá del estudio de patógenos bacterianos, la comunidad de microflora, las interacciones del sistema inmunitario intestinal y las enfermedades, la ASF se ha utilizado en experimentos que examinan la transmisión de retrovirus. En el artículo de Kane et al. , encontraron que el virus del tumor mamario del ratón se transmite de manera más eficiente a través de superficies mucosas colonizadas por bacterias. El retrovirus evolucionó para depender de la interacción con la microbiota y el receptor tipo Toll para evadir las vías inmunitarias. ^{[ 14 ]}

ASF no representa de forma exhaustiva las más de 400 especies bacterianas diversas que normalmente habitan el tracto gastrointestinal de los ratones. Incluso en ratones SPF, existen muchas especies de Helicobacter y Filamentous que no están incluidas en ASF1. Sin mencionar las numerosas bacterias que no pudieron cultivarse en condiciones de laboratorio debido a las necesidades ambientales y de simbiosis inadecuadas. Las bacterias intestinales conforman una compleja comunidad microbiana que se apoya mutuamente y contribuye al desarrollo del tracto gastrointestinal y del sistema inmunitario del huésped.

Muchas bacterias se asocian específicamente para la producción de ciertos metabolitos o vías de señalización que mantienen la supervivencia de la microflora. Por ejemplo, los niveles de hipurato y ácido clorogénico en ratones varían debido a la microflora. La vía de síntesis depende de múltiples especies bacterianas, no todas presentes en la peste porcina africana (PPA). ^{[ 15 ]} Esto limita la biodisponibilidad de nutrientes tanto para el huésped como para el microorganismo.

Para ciertos estudios sobre metabolismo, patogénesis o interacciones microbianas, podría ser necesario añadir cepas bacterianas adicionales. Con solo ocho microorganismos, resulta imposible estudiar la organización completa del microbioma intestinal y todas sus contribuciones al sistema del huésped, especialmente en relación con el desarrollo de enfermedades y la nutrición. Además, existen diferencias entre la microflora de ratones y la humana. Por lo tanto, los estudios que utilizan ratones ASF para describir enfermedades inflamatorias humanas como la EII, la artritis y el cáncer presentan limitaciones. Los ratones ASF solo sirven como base para formular hipótesis sobre ratones con una microflora compleja.

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