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Articulo de referencia

Empalme alternativo

El empalme alternativo produce tres isoformas de proteínas . La proteína A incluye todos los exones, mientras que las proteínas B y C resultan del salto de exones . El empal...

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El empalme alternativo produce tres isoformas de proteínas . La proteína  A incluye todos los exones, mientras que las proteínas  B y C resultan del salto de exones .

El empalme alternativo , el empalme alternativo de ARN o el empalme diferencial es un proceso de empalme alternativo durante la expresión génica que permite que un solo gen produzca diferentes variantes de empalme. Por ejemplo, algunos exones de un gen pueden incluirse o excluirse del producto final de ARN del gen. [ 1 ] Esto significa que los exones se unen en diferentes combinaciones, lo que da lugar a diferentes variantes de empalme. En el caso de los genes que codifican proteínas, las proteínas traducidas a partir de estas variantes de empalme pueden presentar diferencias en su secuencia de aminoácidos y en sus funciones biológicas (véase la figura).

El empalme alternativo biológicamente relevante ocurre como un fenómeno normal en eucariotas , donde aumenta el número de proteínas que puede codificar el genoma. [ 1 ] En humanos, algunos creen que ~95% de los genes multiexónicos se empalman alternativamente para producir productos alternativos funcionales del mismo gen [ 2 ] pero otros creen que la mayoría de las variantes de empalme observadas se deben a errores de empalme y que el número real de genes empalmados alternativamente biológicamente relevantes es mucho menor. [ 3 ] [ 4 ]

Descubrimiento

El empalme alternativo se observó por primera vez en 1977. [ 5 ] [ 6 ] El adenovirus produce cinco transcripciones primarias al inicio de su ciclo infeccioso, antes de la replicación del ADN viral , y una adicional posteriormente, después de que comienza la replicación del ADN. Las transcripciones primarias tempranas continúan produciéndose después de que comienza la replicación del ADN. La transcripción primaria adicional producida al final de la infección es grande y proviene de 5/6 del genoma del adenovirus de 32 kb. Esto es mucho mayor que cualquiera de los ARNm individuales del adenovirus presentes en las células infectadas. Los investigadores descubrieron que la transcripción primaria de ARN producida por el adenovirus tipo  2 en la fase tardía se empalmaba de muchas maneras diferentes, lo que daba como resultado ARNm que codificaban diferentes proteínas virales. Además, la transcripción primaria contenía múltiples sitios de poliadenilación , lo que daba diferentes extremos 3' para los ARNm procesados. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

En 1981, se caracterizó el primer ejemplo de empalme alternativo en un transcrito de un gen endógeno normal . [ 7 ] Se descubrió que el gen que codifica la hormona tiroidea calcitonina se empalmaba alternativamente en células de mamíferos. El transcrito primario de este gen contiene 6 exones; el ARNm de la calcitonina contiene los exones 1-4 y termina después de un sitio de poliadenilación en el exón  4. Otro ARNm se produce a partir de este pre-ARNm omitiendo el exón  4 e incluye los exones 1-3, 5 y 6. Codifica una proteína conocida como CGRP ( péptido relacionado con el gen de la calcitonina ). [ 10 ] [ 11 ] También se observaron ejemplos de empalme alternativo en los transcritos de genes de inmunoglobulinas en mamíferos a principios de la década de 1980. [ 7 ] [ 12 ]

Desde entonces, se han encontrado muchos otros ejemplos de empalme alternativo biológicamente relevante en eucariotas. [ 1 ] El "poseedor del récord" de empalme alternativo es un gen de D.  melanogaster llamado Dscam , que podría tener potencialmente 38.016 variantes de empalme. [ 13 ]

En 2021, se descubrió que el genoma del adenovirus tipo  2, el adenovirus en el que se identificó por primera vez el empalme alternativo, era capaz de producir una variedad mucho mayor de variantes de empalme de lo que se pensaba anteriormente. [ 14 ] Mediante el uso de tecnología de secuenciación de nueva generación, los investigadores pudieron actualizar el  transcriptoma del adenovirus humano tipo 2 y documentar la presencia de 904 variantes de empalme producidas por el virus a través de un complejo patrón de empalme alternativo. Se ha demostrado que muy pocas de estas variantes de empalme son funcionales, un punto que los autores destacan en su artículo.

"Una pregunta pendiente es qué funciones desempeña la variedad de ARN novedosos o si son moléculas espurias generadas por una maquinaria de empalme sobrecargada." [ 14 ]

Modos

Clasificación tradicional de los tipos básicos de eventos de empalme alternativo de ARN. Los exones están representados por bloques azules y amarillos, y los intrones por líneas entre ellos.
Las frecuencias relativas de los tipos de eventos de empalme alternativo difieren entre humanos y moscas de la fruta. [ 15 ]

Generalmente se reconocen cinco modos básicos de empalme alternativo. [ 1 ] [ 2 ] [ 16 ] [ 15 ]

  • Omisión de exones o exón en casete : en este caso, un exón puede ser eliminado del transcrito primario o conservarse. Este es el modo más común en los pre-ARNm de mamíferos . [ 15 ]
  • Exones mutuamente excluyentes : Uno de los dos exones se conserva en los ARNm después del empalme, pero no ambos.
  • Sitio donante alternativo : Se utiliza una unión de empalme 5' alternativa (sitio donante), cambiando el límite 3' del exón corriente arriba .
  • Sitio aceptor alternativo : Se utiliza una unión de empalme 3' alternativa (sitio aceptor), cambiando el límite 5' del exón corriente abajo.
  • Retención de intrones : Una secuencia puede ser eliminada mediante empalme como un intrón o simplemente retenida. Esto se distingue del salto de exones porque la secuencia retenida no está flanqueada por intrones . Si el intrón retenido se encuentra en la región codificante, debe codificar aminoácidos en fase con los exones vecinos; de lo contrario, un codón de parada o un cambio en el marco de lectura provocará que la proteína sea no funcional. Este es el modo menos frecuente en mamíferos, pero el más común en plantas. [ 15 ] [ 17 ]

Además de estos modos primarios de empalme alternativo, existen otros dos mecanismos principales mediante los cuales se pueden generar diferentes ARNm a partir del mismo gen: promotores múltiples y sitios de poliadenilación múltiples . El uso de promotores múltiples se describe propiamente como un mecanismo de regulación transcripcional, más que como empalme alternativo; al iniciar la transcripción en diferentes puntos, se pueden generar transcritos con diferentes exones en el extremo 5'. Por otro lado, los sitios de poliadenilación múltiples proporcionan diferentes extremos 3' para el transcrito. Ambos mecanismos se encuentran en combinación con el empalme alternativo y proporcionan una mayor variedad en los ARNm derivados de un gen. [ 1 ] [ 16 ]

Esquema de la separación entre tres estructuras de empalme en el gen de la hialuronidasa murina . La direccionalidad de la transcripción, de 5' a 3', se muestra de izquierda a derecha. Los exones e intrones no están dibujados a escala.

Estos modelos describen mecanismos básicos de empalme, pero pueden resultar insuficientes para describir eventos de empalme complejos. Por ejemplo, la figura de la derecha muestra tres isoformas de empalme del gen de la hialuronidasa 3 del ratón. La comparación de la estructura exónica mostrada en la primera línea (verde) con la de la segunda línea (amarilla) muestra retención de intrones, mientras que la comparación entre la segunda y la tercera isoforma de empalme (amarilla frente a azul) muestra omisión de exones. Recientemente se ha propuesto una nomenclatura modelo para designar de forma unívoca todos los posibles patrones de empalme. [ 15 ]

Mecanismos

Mecanismo general de empalme

El complejo espliceosoma A define los extremos 5' y 3' del intrón antes de su eliminación. [ 16 ]

Cuando el pre-ARNm se transcribe a partir del ADN , incluye varios intrones y exones . (En los nematodos , el promedio es de 4 a 5 exones e intrones; en la mosca de la fruta Drosophila, puede haber más de 100 intrones y exones en un pre-ARNm transcrito). Los exones que se conservarán en el ARNm se determinan durante el proceso de empalme. La regulación y selección de los sitios de empalme se lleva a cabo mediante proteínas activadoras y represoras del empalme que actúan en trans, así como por elementos que actúan en cis dentro del propio pre-ARNm, como los potenciadores y silenciadores del empalme exónico.

El intrón nuclear eucariota típico posee secuencias consenso que definen regiones importantes. Cada intrón tiene la secuencia GU en su extremo 5'. Cerca del extremo 3' se encuentra un sitio de ramificación. El nucleótido en el punto de ramificación es siempre una A; el consenso alrededor de esta secuencia varía ligeramente. En humanos, la secuencia consenso del sitio de ramificación es yUnAy. [ 18 ] Al sitio de ramificación le sigue una serie de pirimidinas —el tracto de polipirimidinas— y luego AG en el extremo 3'. [ 16 ]

El empalme del ARNm es realizado por un complejo de ARN y proteína conocido como espliceosoma , que contiene snRNP denominadas U1, U2, U4, U5 y U6 (U3 no participa en el empalme del ARNm). [ 19 ] U1 se une al GU 5' y U2, con la ayuda de los factores proteicos U2AF , se une al punto de ramificación A dentro del sitio de ramificación. El complejo en esta etapa se conoce como complejo A del espliceosoma. La formación del complejo A suele ser el paso clave para determinar los extremos del intrón que se empalmarán y definir los extremos del exón que se conservarán. [ 16 ] (La nomenclatura U deriva de su alto contenido de uridina ).

El complejo U4, U5, U6 se une y U6 reemplaza la posición de U1. U1 y U4 se disocian. El complejo restante realiza entonces dos reacciones de transesterificación . En la primera transesterificación, el extremo 5' del intrón se escinde del exón anterior y se une al sitio de ramificación A mediante un enlace fosfodiéster 2',5' . En la segunda transesterificación, el extremo 3' del intrón se escinde del exón posterior y ambos exones se unen mediante un enlace fosfodiéster. El intrón se libera entonces en forma de lazo y se degrada. [ 1 ]

Elementos reguladores y proteínas

represión del empalme

El empalme está regulado por proteínas transactivadoras (represores y activadores) y sitios reguladores cisactivadores correspondientes (silenciadores y potenciadores) en el pre-ARNm. Sin embargo, como parte de la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de un factor de empalme suelen depender de la posición. Es decir, un factor de empalme que actúa como activador cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede actuar como represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. [ 20 ] La estructura secundaria del transcrito de pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del empalme, por ejemplo, al reunir elementos de empalme o al enmascarar una secuencia que de otro modo serviría como elemento de unión para un factor de empalme. [ 21 ] [ 22 ] En conjunto, estos elementos forman un "código de empalme" que rige cómo se producirá el empalme en diferentes condiciones celulares. [ 23 ] [ 24 ]

Hay dos tipos principales de elementos de secuencia de ARN cis-activos presentes en los pre-ARNm y tienen proteínas de unión a ARN trans-activas correspondientes . Los silenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas represoras de empalme, reduciendo la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos pueden estar ubicados en el propio intrón (silenciadores de empalme intrónicos, ISS) o en un exón vecino ( silenciadores de empalme exónicos , ESS). Varían en secuencia, así como en los tipos de proteínas que se unen a ellos. La mayoría de los represores de empalme son ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP) como hnRNPA1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). [ 16 ] [ 23 ] Los potenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas activadoras de empalme, aumentando la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos también pueden ocurrir en el intrón (potenciadores de empalme intrónicos, ISE) o en el exón ( potenciadores de empalme exónicos , ESE). La mayoría de las proteínas activadoras que se unen a los ISE y ESE pertenecen a la familia de proteínas SR . Dichas proteínas contienen motivos de reconocimiento de ARN y dominios ricos en arginina y serina (RS). [ 16 ] [ 23 ]

Activación del empalme

En general, los determinantes del empalme funcionan de manera interdependiente, dependiendo del contexto, de modo que las reglas que rigen su regulación forman un código de empalme. [ 24 ] La presencia de un elemento de secuencia de ARN cis-activo particular puede aumentar la probabilidad de que un sitio cercano sea empalmado en algunos casos, pero disminuirla en otros, dependiendo del contexto. El contexto en el que actúan los elementos reguladores incluye un contexto cis-activo, establecido por la presencia de otras características de la secuencia de ARN, y un contexto trans-activo, establecido por las condiciones celulares. Por ejemplo, algunos elementos de secuencia de ARN cis-activos influyen en el empalme solo si hay múltiples elementos presentes en la misma región para establecer el contexto. Como otro ejemplo, un elemento cis-activo puede tener efectos opuestos en el empalme, dependiendo de las proteínas que se expresan en la célula (por ejemplo, PTB neuronal versus no neuronal). La importancia adaptativa de los silenciadores y potenciadores del empalme está atestiguada por estudios que muestran que existe una fuerte selección en los genes humanos contra las mutaciones que producen nuevos silenciadores o alteran los potenciadores existentes. [ 25 ] [ 26 ]

Ejemplos

Omisión de exones: Drosophila dsx

Empalme alternativo del pre-ARNm de dsx

Los pre-ARNm del gen dsx de Drosophila melanogaster contienen 6 exones. En los machos, los exones 1, 2, 3, 5 y 6 se unen para formar el ARNm, que codifica una proteína reguladora de la transcripción necesaria para el desarrollo masculino. En las hembras, los exones 1, 2, 3 y 4 se unen, y una señal de poliadenilación en el exón 4 provoca la escisión del ARNm en ese punto. El ARNm resultante es una proteína reguladora de la transcripción necesaria para el desarrollo femenino. [ 27 ] 

Este es un ejemplo de omisión de exones. El intrón anterior al exón  4 tiene un tracto de polipirimidina que no coincide bien con la secuencia consenso , por lo que las proteínas U2AF se unen débilmente a él sin la ayuda de activadores de empalme. Por lo tanto, este sitio aceptor de empalme 3' no se utiliza en los machos. Sin embargo, las hembras producen el activador de empalme Transformer (Tra) (véase más abajo). La proteína SR Tra2 se produce en ambos sexos y se une a un ESE en el exón 4; si Tra está presente, se une a Tra2 y, junto con otra proteína SR, forma un complejo que ayuda a las proteínas U2AF a unirse al tracto de polipirimidina débil. U2 es reclutada al punto de ramificación asociado, y esto conduce a la inclusión del exón 4 en el ARNm. [ 27 ] [ 28 ]

Sitios aceptores alternativos: DrosophilaTransformador

Empalme alternativo del producto del gen Transformer de Drosophila

Los pre-ARNm del gen Transformer (Tra) de Drosophila melanogaster experimentan un empalme alternativo mediante el modo de sitio aceptor alternativo. El gen Tra codifica una proteína que se expresa únicamente en hembras. El transcrito primario de este gen contiene un intrón con dos posibles sitios aceptores. En los machos, se utiliza el sitio aceptor corriente arriba. Esto provoca  que se incluya una versión más larga del exón 2 en el transcrito procesado, incluyendo un codón de parada prematuro . El ARNm resultante codifica una proteína truncada que es inactiva. Las hembras producen la proteína maestra de determinación sexual Sex lethal (Sxl). La proteína Sxl es un represor del empalme que se une a un ISS en el ARN del transcrito de Tra cerca del sitio aceptor corriente arriba, impidiendo que la proteína U2AF se una al tracto de polipirimidina. Esto impide el uso de esta unión, desplazando la unión del espliceosoma al sitio aceptor corriente abajo. El empalme en este punto omite el codón de parada, que se escinde como parte del intrón. El ARNm resultante codifica una proteína Tra activa, que a su vez es un regulador del empalme alternativo de otros genes relacionados con el sexo (véase dsx más arriba). [ 1 ]

Definición de exón: receptor Fas

Empalme alternativo del pre-ARNm del receptor Fas

Múltiples isoformas de la proteína receptora Fas se producen por empalme alternativo. Dos isoformas que ocurren normalmente en humanos se producen por un mecanismo de omisión de exones. Un ARNm que incluye el exón  6 codifica la forma unida a la membrana del receptor Fas, que promueve la apoptosis o muerte celular programada. El aumento de la expresión del receptor Fas en células de la piel crónicamente expuestas al sol, y la ausencia de expresión en células de cáncer de piel, sugiere que este mecanismo puede ser importante en la eliminación de células precancerosas en humanos. [ 29 ] Si  se omite el exón 6, el ARNm resultante codifica una proteína Fas soluble que no promueve la apoptosis. La inclusión o la omisión del exón depende de dos proteínas antagónicas, TIA-1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB).

  • El sitio donador 5' en el intrón corriente abajo del exón  6 en el pre-ARNm tiene una concordancia débil con la secuencia consenso y, por lo general, no se une a la snRNP U1. Si U1 no se une, el exón se omite (ver "a" en la figura adjunta).
  • La unión de la proteína TIA-1 a un sitio potenciador de empalme intrónico estabiliza la unión de la snRNP U1. [ 16 ] El complejo resultante del sitio donador 5' ayuda a la unión del factor de empalme U2AF al sitio de empalme 3' corriente arriba del exón, a través de un mecanismo que aún se desconoce (ver b). [ 30 ]
  • El exón 6 contiene un silenciador de empalme exónico rico en pirimidinas, ure6 , donde puede unirse PTB. Si PTB se une, inhibe el efecto del complejo donador 5' sobre la unión de U2AF al sitio aceptor, lo que resulta en la omisión del exón (ver c).

Este mecanismo es un ejemplo de definición de exones en el empalme. Un espliceosoma se ensambla en un intrón, y las subunidades snRNP pliegan el ARN de manera que los extremos 5' y 3' del intrón se unen. Sin embargo, ejemplos estudiados recientemente, como este, muestran que también existen interacciones entre los extremos del exón. En este caso particular, estas interacciones de definición de exones son necesarias para permitir la unión de los factores centrales del empalme antes del ensamblaje de los espliceosomas en los dos intrones flanqueantes. [ 30 ]

Competencia entre represores y activadores: exón 2 del gen tat del VIH-1

 Empalme alternativo del exón 2 del gen tat del VIH-1

El VIH , el retrovirus que causa el SIDA en humanos, produce un único transcrito de ARN primario, que se empalma alternativamente de múltiples maneras para producir más de 40 ARNm diferentes. [ 31 ] El equilibrio entre los transcritos empalmados diferencialmente proporciona múltiples ARNm que codifican diferentes productos que son necesarios para la multiplicación viral. [ 32 ] Uno de los transcritos empalmados diferencialmente contiene el gen tat  , en el que el exón 2 es un exón de casete que puede ser omitido o incluido. La inclusión del exón  2 de tat en el ARN está regulada por la competencia entre el represor de empalme hnRNP A1 y la proteína SR SC35. Dentro del exón  2 se superponen una secuencia silenciadora de empalme exónica (ESS) y una secuencia potenciadora de empalme exónica (ESE). Si la proteína represora A1 se une al ESS, inicia la unión cooperativa de múltiples moléculas de A1, extendiéndose hacia el sitio donador 5' aguas arriba del exón  2 e impidiendo la unión del factor de empalme central U2AF35 al tracto de polipirimidina. Si SC35 se une al ESE, impide la unión de A1 y mantiene el sitio donador 5' en un estado accesible para el ensamblaje del espliceosoma. La competencia entre el activador y el represor asegura que  se produzcan ambos tipos de ARNm (con y sin exón 2). [ 31 ]

Importancia adaptativa

El empalme alternativo genuino ocurre tanto en genes codificadores de proteínas como en genes no codificantes para producir múltiples productos (proteínas o ARN no codificantes). Se necesita información externa para decidir qué producto se produce, dada una secuencia de ADN y el transcrito inicial. Dado que los métodos de regulación son heredados, esto proporciona nuevas formas para que las mutaciones afecten la expresión génica. [ 33 ]

El empalme alternativo puede proporcionar flexibilidad evolutiva. Una sola mutación puntual puede causar que un exón determinado se excluya o incluya ocasionalmente de un transcrito durante el empalme, permitiendo la producción de una nueva isoforma de proteína sin pérdida de la proteína original. [ 1 ] Los estudios han identificado regiones intrínsecamente desordenadas (véase Proteínas intrínsecamente no estructuradas ) como enriquecidas en los exones no constitutivos [ 34 ] lo que sugiere que las isoformas de proteínas pueden mostrar diversidad funcional debido a la alteración de módulos funcionales dentro de estas regiones. Dicha diversidad funcional lograda por las isoformas se refleja en sus patrones de expresión y puede predecirse mediante enfoques de aprendizaje automático. [ 35 ] [ 36 ] Los estudios comparativos indican que el empalme alternativo precedió a la multicelularidad en la evolución, y sugieren que este mecanismo podría haber sido cooptado para ayudar en el desarrollo de organismos multicelulares. [ 37 ]

La investigación basada en el Proyecto Genoma Humano y otras secuenciaciones genómicas ha demostrado que los humanos tienen solo alrededor de un 30% más de genes que el nematodo Caenorhabditis elegans , y solo alrededor del doble que la mosca Drosophila melanogaster . Este hallazgo llevó a especular que la mayor complejidad percibida de los humanos, o de los vertebrados en general, podría deberse a tasas más altas de empalme alternativo en los humanos que las que se encuentran en los invertebrados. [ 38 ] [ 39 ] Sin embargo, un estudio en muestras de 100 000 etiquetas de secuencia expresada (EST) de cada uno de los humanos, ratones, ratas, vacas, moscas ( D.  melanogaster ), gusanos ( C.  elegans ) y la planta Arabidopsis thaliana no encontró grandes diferencias en la frecuencia de genes de empalme alternativo entre los humanos y cualquiera de los otros animales analizados. [ 40 ] Otro estudio, sin embargo, propuso que estos resultados eran un artefacto de las diferentes cantidades de EST disponibles para los diversos organismos. Cuando compararon las frecuencias de empalme alternativo en subconjuntos aleatorios de genes de cada organismo, los autores concluyeron que los vertebrados tienen tasas más altas de empalme alternativo que los invertebrados. [ 41 ]

Enfermedad

Los cambios en la maquinaria de procesamiento del ARN pueden conducir al empalme incorrecto de múltiples transcritos, mientras que las alteraciones de un solo nucleótido en los sitios de empalme o los sitios reguladores de empalme de acción cis pueden conducir a diferencias en el empalme de un solo gen y, por lo tanto, en el ARNm producido a partir de los transcritos de un gen mutante. Un estudio en 2005 que involucró análisis probabilísticos indicó que más del 60% de las mutaciones causantes de enfermedades humanas afectan el empalme en lugar de afectar directamente las secuencias codificantes. [ 42 ] Un estudio más reciente indica que un tercio de todas las enfermedades hereditarias probablemente tengan un componente de empalme. [ 20 ] Independientemente del porcentaje exacto, existen varias enfermedades relacionadas con el empalme. [ 43 ] Como se describe a continuación, un ejemplo prominente de enfermedades relacionadas con el empalme es el cáncer.

También se encuentran ARNm empalmados anormalmente en una alta proporción de células cancerosas. [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] Los análisis combinados de RNA-Seq y proteómica han revelado una expresión diferencial sorprendente de isoformas de empalme de proteínas clave en vías importantes del cáncer. [ 47 ] No siempre está claro si tales patrones aberrantes de empalme contribuyen al crecimiento canceroso, o son simplemente consecuencia de anomalías celulares asociadas con el cáncer. Para ciertos tipos de cáncer, como en el colorrectal y el de próstata, se ha demostrado que el número de errores de empalme por cáncer varía mucho entre cánceres individuales, un fenómeno conocido como inestabilidad del transcriptoma . [ 48 ] [ 49 ] Se ha demostrado además que la inestabilidad del transcriptoma se correlaciona mucho con un nivel de expresión reducido de genes de factores de empalme. Se ha demostrado que la mutación de DNMT3A contribuye a las neoplasias hematológicas y que las líneas celulares con mutación de DNMT3A presentan inestabilidad transcriptómica en comparación con sus contrapartes isogénicas de tipo silvestre. [ 50 ]

De hecho, en realidad hay una reducción del empalme alternativo en las células cancerosas en comparación con las normales, y los tipos de empalme difieren; por ejemplo, las células cancerosas muestran niveles más altos de retención de intrones que las células normales, pero niveles más bajos de salto de exones. [ 51 ] Algunas de las diferencias en el empalme en las células cancerosas pueden deberse a la alta frecuencia de mutaciones somáticas en los genes de los factores de empalme, [ 46 ] y algunas pueden resultar de cambios en la fosforilación de los factores de empalme trans-actuantes. [ 33 ] Otras pueden ser producidas por cambios en las cantidades relativas de factores de empalme producidos; por ejemplo, se ha demostrado que las células de cáncer de mama tienen niveles aumentados del factor de empalme SF2/ASF . [ 52 ] Un estudio encontró que un porcentaje relativamente pequeño (383 de más de 26000) de variantes de empalme alternativo eran significativamente más frecuentes en células tumorales que en células normales, lo que sugiere que hay un conjunto limitado de genes que, cuando se empalman incorrectamente, contribuyen al desarrollo del tumor. [ 53 ] Sin embargo, se cree que los efectos nocivos de los transcritos empalmados incorrectamente suelen estar protegidos y eliminados por un mecanismo celular de control de calidad postranscripcional denominado degradación de ARNm mediada por codones de terminación prematura [NMD]. [ 54 ]

Un ejemplo de una variante de empalme específica asociada con el cáncer se encuentra en uno de los genes DNMT humanos. Tres genes DNMT codifican enzimas que añaden grupos metilo al ADN, una modificación que a menudo tiene efectos reguladores. Se han encontrado varios ARNm DNMT3B con empalme anómalo en tumores y líneas celulares cancerosas. En dos estudios independientes, la expresión de dos de estos ARNm con empalme anómalo en células de mamíferos provocó cambios en los patrones de metilación del ADN en dichas células. Las células con uno de los ARNm anómalos también crecieron el doble de rápido que las células de control, lo que indica una contribución directa de este producto al desarrollo tumoral. [ 33 ]

Otro ejemplo es el protooncogén Ron ( MST1R ) . Una propiedad importante de las células cancerosas es su capacidad para moverse e invadir el tejido normal. Se ha descubierto que la producción de un transcrito de Ron con empalme anómalo está asociada con niveles elevados de SF2/ASF en células de cáncer de mama. La isoforma anómala de la proteína Ron codificada por este ARNm conduce a la motilidad celular . [ 52 ]

La sobreexpresión de una variante de empalme truncada del gen FOSB – ΔFosB – en una población específica de neuronas en el núcleo accumbens se ha identificado como el mecanismo causal involucrado en la inducción y el mantenimiento de una adicción a las drogas y las recompensas naturales . [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ]

Estudios recientes y provocadores señalan una función clave de la estructura de la cromatina y las modificaciones de las histonas en la regulación del empalme alternativo. Estos hallazgos sugieren que la regulación epigenética determina no solo qué partes del genoma se expresan, sino también cómo se empalman. [ 59 ]

Análisis a escala genómica (de todo el transcriptoma)

El análisis del empalme alternativo a nivel de todo el transcriptoma se realiza típicamente mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento. Lo más común es la secuenciación de lectura corta, como la que se realiza con instrumentación Illumina. Sin embargo, la secuenciación de lectura larga, como la que se realiza con instrumentación Nanopore o PacBio, ofrece información aún más completa. Los análisis del transcriptoma pueden utilizarse, por ejemplo, para medir la cantidad de empalme alternativo atípico, como en una cohorte de pacientes con cáncer. [ 60 ]

Las tecnologías de secuenciación profunda se han utilizado para realizar análisis genómicos de ARNm procesados ​​y no procesados, lo que proporciona información sobre el empalme alternativo. Por ejemplo, los resultados del uso de la secuenciación profunda indican que, en humanos, se estima que el 95 % de los transcritos de genes multiexónicos experimentan empalme alternativo, con varios transcritos de pre-ARNm empalmados de manera específica de tejido. [ 2 ] También se han desarrollado enfoques de genómica funcional y computacionales basados ​​en el aprendizaje de instancias múltiples para integrar datos de RNA-seq y predecir funciones para isoformas empalmadas alternativamente. [ 36 ] La secuenciación profunda también ha ayudado en la detección in vivo de los lazos transitorios que se liberan durante el empalme, la determinación de secuencias de sitios de ramificación y el mapeo a gran escala de puntos de ramificación en transcritos de pre-ARNm humanos. [ 61 ]

Históricamente, se han encontrado transcripciones con empalme alternativo comparando secuencias EST , pero esto requiere la secuenciación de un número muy grande de EST. La mayoría de las bibliotecas de EST provienen de un número muy limitado de tejidos, por lo que es probable que se pasen por alto las variantes de empalme específicas de tejido. Sin embargo, se han desarrollado enfoques de alto rendimiento para investigar el empalme, como los análisis basados ​​en microarrays de ADN , los ensayos de unión de ARN y la secuenciación profunda . Estos métodos se pueden utilizar para detectar polimorfismos o mutaciones en o alrededor de los elementos de empalme que afectan la unión de proteínas. Cuando se combinan con ensayos de empalme, incluidos los ensayos de genes reporteros in vivo , se pueden analizar los efectos funcionales de los polimorfismos o mutaciones en el empalme de las transcripciones de pre-ARNm. [ 20 ] [ 23 ] [ 62 ]

En el análisis de microarrays, se han utilizado matrices de fragmentos de ADN que representan exones individuales ( por ejemplo, la micromatriz de exones de Affymetrix ) o límites entre exones ( por ejemplo, matrices de ExonHit o Jivan ). La matriz se hibrida con ADNc marcado procedente de los tejidos de interés. Las sondas de ADNc se unen al ADN de los exones incluidos en los ARNm de su tejido de origen, o al ADN del límite donde se han unido dos exones. Esto puede revelar la presencia de ARNm con empalme alternativo. [ 63 ]

CLIP ( Cross-linking and immunoprecipitation ) utiliza radiación UV para unir proteínas a moléculas de ARN en un tejido durante el empalme. Una proteína reguladora de empalme trans-activa de interés se precipita luego utilizando anticuerpos específicos. Cuando el ARN unido a esa proteína se aísla y clona, ​​revela las secuencias objetivo para esa proteína. [ 64 ] Otro método para identificar proteínas de unión a ARN y mapear su unión a transcritos de pre-ARNm es "Microarray Evaluation of Genomic Aptamers by shift (MEGAshift)".net [ 65 ] Este método implica una adaptación del método "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)" [ 66 ] junto con una lectura basada en microarrays. El uso del método MEGAshift ha proporcionado información sobre la regulación del empalme alternativo al permitir la identificación de secuencias en los transcritos de pre-ARNm que rodean los exones empalmados alternativamente y que median la unión a diferentes factores de empalme, como ASF/SF2 y PTB. [ 67 ] Este enfoque también se ha utilizado para ayudar a determinar la relación entre la estructura secundaria del ARN y la unión de los factores de empalme. [ 22 ]

El uso de ensayos con genes reporteros permite identificar las proteínas implicadas en un evento específico de empalme alternativo mediante la construcción de genes reporteros que expresan una de dos proteínas fluorescentes diferentes según la reacción de empalme que se produzca. Este método se ha utilizado para aislar mutantes que afectan al empalme y, por lo tanto, para identificar nuevas proteínas reguladoras del empalme inactivadas en dichos mutantes. [ 64 ]

Los recientes avances en la predicción de la estructura de proteínas han facilitado el desarrollo de nuevas herramientas para la anotación del genoma y el análisis del empalme alternativo. Por ejemplo, isoform.io, una plataforma guiada por predicciones de la estructura de proteínas, ha evaluado cientos de miles de isoformas de genes humanos codificadores de proteínas, recopiladas a partir de numerosos experimentos de secuenciación de ARN en diversos tejidos humanos. Este análisis exhaustivo ha permitido identificar numerosas isoformas con una estructura predicha con mayor confianza y una función potencialmente superior en comparación con las isoformas canónicas en la base de datos genética humana más reciente. Al integrar las predicciones estructurales con la expresión y la evidencia evolutiva, este enfoque ha demostrado el potencial de la predicción de la estructura de proteínas como herramienta para refinar la anotación del genoma humano. [ 68 ]

Bases de datos

Hay una colección de bases de datos de empalme alternativo. [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ] Estas bases de datos son útiles para encontrar genes que tienen pre-ARNm que experimentan empalme alternativo y eventos de empalme alternativo o para estudiar el impacto funcional del empalme alternativo.

Véase también

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  56. ↑ Ruffle JK (noviembre de 2014). "Neurobiología molecular de la adicción: ¿de qué se trata todo esto de (Δ)FosB?". The American Journal of Drug and Alcohol Abuse . 40 (6): 428– 37. doi : 10.3109/00952990.2014.933840 . PMID 25083822. S2CID 19157711. ΔFosB es un factor de transcripción esencial implicado en las vías moleculares y conductuales de la adicción tras la exposición repetida a drogas. La formación de ΔFosB en múltiples regiones cerebrales y la vía molecular que conduce a la formación de complejos AP-1 se comprenden bien. El establecimiento de una función para ΔFosB ha permitido determinar con mayor precisión algunos de los aspectos clave de sus cascadas moleculares, que involucran efectores como GluR2 (87,88), Cdk5 (93) y NFkB (100). Además, muchos de estos cambios moleculares identificados están ahora directamente relacionados con los cambios estructurales, fisiológicos y conductuales observados tras la exposición crónica a fármacos (60,95,97,102). Los estudios epigenéticos han abierto nuevas fronteras en la investigación de las funciones moleculares de ΔFosB, y los avances recientes han ilustrado su papel en el ADN y las histonas, actuando como un interruptor molecular (34). Gracias a una mejor comprensión de ΔFosB en la adicción, es posible evaluar el potencial adictivo de los medicamentos actuales (119), así como utilizarlo como biomarcador para evaluar la eficacia de las intervenciones terapéuticas (121,122,124). Algunas de estas intervenciones propuestas tienen limitaciones (125) o se encuentran en su fase inicial (75). Sin embargo, se espera que algunos de estos hallazgos preliminares puedan dar lugar a tratamientos innovadores, muy necesarios en el ámbito de la adicción.  
  57. ↑ Biliński P, Wojtyła A , Kapka-Skrzypczak L, Chwedorowicz R, Cyranka M, Studziński T (2012). "Regulación epigenética en la adicción a las drogas". Annals of Agricultural and Environmental Medicine . 19 (3): 491– 6. PMID 23020045. Por estas razones, ΔFosB se considera un factor de transcripción primario y causal en la creación de nuevas conexiones neuronales en el centro de recompensa, la corteza prefrontal y otras regiones del sistema límbico. Esto se refleja en el nivel de sensibilidad aumentado, estable y duradero a la cocaína y otras drogas, y la tendencia a recaer incluso después de largos períodos de abstinencia. Estas redes recién construidas funcionan de manera muy eficiente a través de nuevas vías tan pronto como se toman más drogas de abuso. 
  58. ↑ Olsen CM (diciembre de 2011). " Recompensas naturales, neuroplasticidad y adicciones no farmacológicas" . Neuropharmacology . 61 (7): 1109–22 . doi : 10.1016/j.neuropharm.2011.03.010 . PMC 3139704. PMID 21459101 .  
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  • IsoPred: funciones de isoformas predichas computacionalmente
  • Stamms-lab.net: Grupo de investigación que se ocupa de los problemas de empalme alternativo y el empalme erróneo en enfermedades humanas.
  • El empalme alternativo de canales iónicos en el cerebro está relacionado con enfermedades mentales y neurológicas.
  • BIPASS: Servicios web en el empalme alternativo
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