secuenciación de proteínas

La hidrólisis se realiza calentando una muestra de la proteína en ácido clorhídrico 6 M a 100–110  °C durante 24 horas o más. Las proteínas con muchos grupos hidrofóbicos voluminosos pueden requerir períodos de calentamiento más prolongados. Sin embargo, estas condiciones son tan intensas que algunos aminoácidos ( serina , treonina , tirosina , triptófano , glutamina y cisteína ) se degradan. Para evitar este problema, Biochemistry Online sugiere calentar muestras separadas durante diferentes tiempos, analizar cada solución resultante y extrapolar hacia atrás hasta un tiempo de hidrólisis cero. Rastall sugiere una variedad de reactivos para prevenir o reducir la degradación, como reactivos tiólicos o fenol para proteger el triptófano y la tirosina del ataque del cloro, y la preoxidación de la cisteína. También sugiere medir la cantidad de amoníaco liberado para determinar el grado de hidrólisis de la amida .

Los aminoácidos se pueden separar mediante cromatografía de intercambio iónico y luego derivatizar para facilitar su detección. Más comúnmente, los aminoácidos se derivatizan y luego se analizan mediante HPLC de fase inversa .

Un ejemplo de cromatografía de intercambio iónico lo proporciona el NTRC utilizando poliestireno sulfonado como matriz, añadiendo los aminoácidos en solución ácida y haciendo pasar una solución tampón de pH creciente a través de la columna. Los aminoácidos se eluyen cuando el pH alcanza sus respectivos puntos isoeléctricos . Una vez separados los aminoácidos, sus cantidades respectivas se determinan añadiendo un reactivo que formará un derivado coloreado. Si las cantidades de aminoácidos superan los 10 nmol, se puede utilizar ninhidrina para ello; esta produce un color amarillo al reaccionar con prolina y un púrpura intenso con otros aminoácidos. La concentración de aminoácido es proporcional a la absorbancia de la solución resultante. Con cantidades muy pequeñas, hasta 10 pmol, se pueden formar derivados fluorescentes utilizando reactivos como el orto-ftaldehído (OPA) o la fluorescamina .

La derivatización precolumna puede emplear el reactivo de Edman para producir un derivado detectable mediante luz ultravioleta. Se logra mayor sensibilidad utilizando un reactivo que genera un derivado fluorescente. Los aminoácidos derivatizados se someten a cromatografía de fase inversa, generalmente con una columna de sílice C8 o C18 y un gradiente de elución optimizado . Los aminoácidos eluidos se detectan mediante un detector UV o de fluorescencia, y las áreas de los picos se comparan con las de los estándares derivatizados para cuantificar cada aminoácido en la muestra.

Los péptidos de más de 50-70 aminoácidos no pueden secuenciarse de forma fiable mediante la degradación de Edman. Por ello, es necesario fragmentar las cadenas proteicas largas en pequeños fragmentos que puedan secuenciarse individualmente. La digestión se realiza mediante endopeptidasas como la tripsina o la pepsina , o con reactivos químicos como el bromuro de cianógeno . Las distintas enzimas generan diferentes patrones de corte, y la superposición entre los fragmentos permite reconstruir la secuencia completa.

El péptido que se va a secuenciar se adsorbe sobre una superficie sólida. Un sustrato común es la fibra de vidrio recubierta con polibreno , un polímero catiónico . Se añade el reactivo de Edman, fenilisotiocianato (PITC), al péptido adsorbido, junto con una solución tampón ligeramente básica de trimetilamina al 12 % . Este reactivo reacciona con el grupo amino del aminoácido N-terminal.

El aminoácido terminal se puede separar selectivamente mediante la adición de ácido anhidro . El derivado se isomeriza para dar lugar a una feniltiohidantoína sustituida , que se puede eliminar mediante lavado e identificar por cromatografía, y el ciclo se puede repetir. La eficiencia de cada paso es de aproximadamente el 98%, lo que permite determinar con fiabilidad unos 50 aminoácidos.

Un secuenciador de proteínas ^{[ 3 ]} es una máquina que realiza la degradación de Edman de forma automatizada. Una muestra de la proteína o péptido se inmoviliza en el recipiente de reacción del secuenciador y se lleva a cabo la degradación de Edman. En cada ciclo, se libera y derivatiza un aminoácido del extremo N- terminal de la proteína o péptido, y el derivado de aminoácido liberado se identifica mediante HPLC. El proceso de secuenciación se repite para todo el polipéptido hasta que se establece la secuencia medible completa o durante un número predeterminado de ciclos.

Se describe un esquema general para la identificación de proteínas. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

1. La proteína de interés se aísla, normalmente mediante SDS-PAGE o cromatografía .
2. La proteína de interés aislada puede modificarse químicamente para estabilizar los residuos de cisteína (por ejemplo, mediante S-amidometilación o S-carboximetilación).
3. La proteína de interés (POI) se digiere con una proteasa específica para generar péptidos. La tripsina , que corta selectivamente en el extremo C-terminal de los residuos de lisina o arginina, es la proteasa más utilizada. Sus ventajas incluyen: i) la frecuencia de residuos de lisina y arginina en las proteínas, ii) la alta especificidad de la enzima, iii) la estabilidad de la enzima y iv) la idoneidad de los péptidos trípticos para la espectrometría de masas.
4. Los péptidos pueden desalarse para eliminar contaminantes ionizables y someterse a espectrometría de masas MALDI-TOF . La medición directa de las masas de los péptidos puede proporcionar información suficiente para identificar la proteína (véase Huella dactilar de masas de péptidos ), pero a menudo se utiliza una fragmentación adicional de los péptidos dentro del espectrómetro de masas para obtener información sobre sus secuencias. Alternativamente, los péptidos pueden desalarse y separarse mediante HPLC de fase inversa e introducirse en un espectrómetro de masas a través de una fuente ESI . La LC-ESI-MS puede proporcionar más información que la MALDI-MS para la identificación de proteínas, pero requiere más tiempo de instrumentación.
5. Según el tipo de espectrómetro de masas, la fragmentación de los iones peptídicos puede ocurrir mediante diversos mecanismos, como la disociación inducida por colisión (CID) o la desintegración posterior a la fuente (PSD). En cada caso, el patrón de iones fragmentados de un péptido proporciona información sobre su secuencia.
6. La información, incluyendo la masa medida de los supuestos iones peptídicos y la de sus iones fragmento, se compara con los valores de masa calculados a partir de la proteólisis y fragmentación conceptual (in silico) de bases de datos de secuencias de proteínas. Se considera que existe una coincidencia si su puntuación supera un umbral basado en los parámetros de análisis. Incluso si la proteína en cuestión no está representada en la base de datos, la comparación tolerante a errores permite la identificación de una proteína basada en su similitud con proteínas homólogas . Existen diversos paquetes de software disponibles para realizar este análisis.
7. Los paquetes de software suelen generar un informe que muestra la identidad (código de acceso) de cada proteína identificada, su puntuación de coincidencia y proporcionan una medida de la fuerza relativa de la coincidencia cuando se identifican varias proteínas.
8. Un diagrama de los péptidos coincidentes en la secuencia de la proteína identificada se utiliza a menudo para mostrar la cobertura de la secuencia (% de la proteína detectada como péptidos). Cuando se cree que el péptido de interés (POI) es significativamente más pequeño que la proteína coincidente, el diagrama puede sugerir si el POI es un fragmento N- o C-terminal de la proteína identificada.

El patrón de fragmentación de un péptido permite determinar directamente su secuencia mediante secuenciación de novo . Esta secuencia puede utilizarse para compararla con bases de datos de secuencias de proteínas o para investigar modificaciones postraduccionales o químicas. Además, puede aportar información adicional para las identificaciones de proteínas realizadas como se describió anteriormente.

Los péptidos identificados durante la identificación de proteínas no necesariamente incluyen los extremos N o C predichos para la proteína identificada. Esto puede deberse a que los péptidos N o C terminales son difíciles de identificar mediante espectrometría de masas (por ejemplo, por ser demasiado cortos o demasiado largos), están modificados postraduccionalmente (por ejemplo, por acetilación del extremo N) o difieren realmente de la predicción. Las modificaciones postraduccionales o los extremos truncados pueden identificarse mediante un análisis más detallado de los datos (es decir, secuenciación de novo ). También puede resultar útil repetir la digestión con una proteasa de diferente especificidad.

Si bien la comparación detallada de los datos de espectrometría de masas con las predicciones basadas en la secuencia proteica conocida puede utilizarse para definir las modificaciones postraduccionales, también se pueden emplear enfoques específicos para la adquisición de datos. Por ejemplo, el enriquecimiento específico de fosfopéptidos puede ayudar a identificar los sitios de fosforilación en una proteína. Los métodos alternativos de fragmentación de péptidos en el espectrómetro de masas, como ETD o ECD , pueden proporcionar información de secuencia complementaria.

La masa total de una proteína es la suma de las masas de sus residuos de aminoácidos más la masa de una molécula de agua, ajustada según las modificaciones postraduccionales. Si bien las proteínas se ionizan con menor eficacia que los péptidos derivados de ellas, una proteína en solución puede someterse a ESI-MS y su masa puede medirse con una precisión de 1 parte en 20 000 o superior. Esto suele ser suficiente para confirmar los extremos (de modo que la masa medida de la proteína coincida con la predicha a partir de su secuencia) e inferir la presencia o ausencia de numerosas modificaciones postraduccionales.

La proteólisis no siempre produce un conjunto de péptidos fácilmente analizables que abarquen la secuencia completa de la proteína de interés. La fragmentación de péptidos en el espectrómetro de masas a menudo no genera iones correspondientes a la ruptura de cada enlace peptídico. Por lo tanto, la secuencia deducida para cada péptido no es necesariamente completa. Los métodos estándar de fragmentación no distinguen entre residuos de leucina e isoleucina, ya que son isómeros.

Dado que la degradación de Edman se inicia en el extremo N-terminal de la proteína, no funciona si este extremo ha sido modificado químicamente (por ejemplo, mediante acetilación o formación de ácido piroglutámico). La degradación de Edman generalmente no es útil para determinar la posición de los puentes disulfuro. Además, requiere cantidades de péptido de 1 picomol o superiores para obtener resultados discernibles, lo que la hace menos sensible que la espectrometría de masas .