Genómica de patógenos antiguos

La conservación limitada y, por lo tanto, la baja abundancia, el estado altamente fragmentado y dañado, así como la presencia de contaminación por ADN moderno y de ADN ambiental de fondo, hacen que la recuperación de ADN antiguo ( aDNA ) sea un procedimiento complejo.

Para recuperar eficientemente el ADN antiguo, este se aísla generalmente de tejidos que contienen una alta cantidad de ADN antiguo, como huesos y dientes, que son abundantes en el registro arqueológico. ^{[ 1 ]} La preservación de patógenos en diferentes elementos anatómicos es muy variable según el tipo de patógeno y su tropismo tisular, su vía de entrada al cuerpo y la enfermedad resultante. Los patógenos que causan infecciones crónicas en sus huéspedes suelen producir cambios óseos diagnósticos, a diferencia de las infecciones agudas transmitidas por la sangre. ^{[ 1 ]} Por lo tanto, para aquellas infecciones que han causado la muerte del huésped en la fase aguda, el material de muestreo preferido es la cámara interna de los dientes ^{[ 1 ] [ 3 ]} ya que este es un tejido altamente vascularizado durante la vida. ^{[ 4 ]}

El ADN antiguo se caracteriza por daños que se acumulan con el tiempo: la evaluación del "patrón de daño" del ADN mediante herramientas computacionales es útil para autenticar el ADN de patógenos antiguos, ya que el mismo patrón no se encuentra en los contaminantes modernos. ^{[ 5 ]}

El daño químico más frecuente que afecta al ADN post mortem es la desaminación hidrolítica de las citosinas , que las convierte en uracilos, los cuales se leen como timinas . Debido a esta reacción, el ADN antiguo contiene una proporción inesperada de transiciones de citosina a timina , en particular en los extremos de las moléculas. ^{[ 6 ]} Otras modificaciones comunes del ADN, además de la desaminación de la citosina a timina (que ocurre cuando las citosinas están metiladas), son la presencia de sitios apurínicos/ apirimidínicos y roturas de cadena simple. ^{[ 5 ]}

El ADN antiguo está extensamente fragmentado (la mayoría de los fragmentos tienen menos de 100 pares de bases): esta tendencia puede utilizarse como medida cuantitativa de autenticidad, ya que se espera que las moléculas contaminantes modernas sean más largas. ^{[ 4 ]} Para aprovechar esta característica del ADN antiguo, se introdujeron protocolos de extracción mejorados basados ​​en sílice con volumen y composición modificados del tampón de unión al ADN. ^{[ 5 ]}

Para poder secuenciarse con métodos de secuenciación de segunda generación, las moléculas plantilla deben modificarse mediante la ligación de adaptadores. ^{[ 7 ]} Tanto los pasos de construcción de la biblioteca como la amplificación por PCR posterior están sujetos a errores. En particular, pueden producirse sesgos en la unión de los adaptadores y la eficacia relativa de las enzimas de PCR en la amplificación del constructo puede ser variable. ^{[ 5 ]}

Existen tres tipos principales de bibliotecas de ADN antiguo . La biblioteca de ADN de doble cadena utiliza plantillas de ADN de doble cadena y requiere, en primer lugar, un paso para la reparación de los extremos de los fragmentos de ADN antiguo. A continuación, los fragmentos se ligan a adaptadores de doble cadena y se rellenan las muescas resultantes . Este método presenta algunas limitaciones, como la presencia de una fracción de construcciones que no contienen ambos adaptadores diferentes y la posible formación de dímeros de adaptadores. ^{[ 5 ]}

Para superar este último problema, se desarrolló un método para la construcción de una biblioteca con cola de adenina. En este método, el ADN antiguo se repara en sus extremos y luego se añade un residuo de adenina a los extremos 3' de las hebras, lo que facilita la ligación del molde con adaptadores que contienen un residuo de timina. Además, el uso de estos adaptadores con cola de timina evita la formación de dímeros de adaptadores. El tipo de adaptador que se utiliza habitualmente es de doble hebra y tiene forma de Y, lo que significa que tiene una región complementaria en el extremo con cola de timina y una región no complementaria en el otro extremo. El uso de este tipo de adaptadores permite generar un molde de ADN antiguo flanqueado por diferentes secuencias de adaptadores no complementarias en cada extremo, útiles para la secuenciación unidireccional. ^{[ 5 ]}

Otra estrategia se basa en el uso de bibliotecas de ADN monocatenario. En este método, el ADN se desnaturaliza primero mediante calor para generar una cadena simple, que luego se liga a un adaptador biotinilado monocatenario . La cadena de ADN se utiliza como molde por una ADN polimerasa , que produce la cadena complementaria. Posteriormente, se liga un segundo adaptador al extremo 3' de la cadena complementaria y la construcción completa se amplifica mediante PCR y luego se secuencia. El paso de purificación se realiza utilizando microesferas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina , lo que permite minimizar la pérdida de ADN durante esta fase del procedimiento. ^{[ 5 ]}

Se han desarrollado diferentes métodos (denominados métodos de enriquecimiento) para mejorar la accesibilidad al ADN endógeno en restos antiguos. Estos enfoques se pueden dividir principalmente en tres tipos: los utilizados durante la construcción de la biblioteca, mediante la incorporación preferencial de fragmentos de ADN antiguo caracterizados por un alto nivel de daño; los aplicados después de la construcción de la biblioteca, mediante la separación de fracciones exógenas y endógenas a través del apareamiento con conjuntos predefinidos de sondas (en solución o en microarrays ); o los basados ​​en la digestión dirigida del ADN microbiano ambiental utilizando enzimas de restricción y captura por extensión de cebadores (PEC). ^{[ 5 ]}

El análisis de datos de secuencia obtenidos mediante NGS se basa en los mismos enfoques computacionales utilizados para el ADN moderno, con algunas particularidades. Una herramienta ampliamente utilizada para alinear lecturas de ADN antiguo con genomas de referencia es el paquete PALEOMIX, que puede cuantificar los niveles de daño del ADN mediante mapDamage2 y realizar análisis filogenómicos y metagenómicos. Es importante considerar que la alineación siempre presentará fracciones sustanciales de nucleótidos no coincidentes que no resultan de errores de secuenciación o polimorfismos, sino de la presencia de bases dañadas. Por esta razón, el umbral de aceptación para la distancia de edición de lectura a referencia debe elegirse de acuerdo con la distancia filogenética al genoma de referencia . Se han desarrollado alineadores probabilísticos que tienen en cuenta el patrón de daño del ADN antiguo para mejorar las alineaciones. ^{[ 5 ]}

Los estudios del ADN antiguo de patógenos se limitan a colecciones de esqueletos que cambian de aspecto como resultado de infecciones. Un patógeno vinculado a un contexto epidemiológico conocido se identifica mediante cribado sin conocimiento previo de su presencia. Los métodos incluyen enfoques moleculares de amplio espectro centrados en la detección de patógenos mediante tecnología de microarrays basada en hibridación por fluorescencia, identificación mediante enriquecimiento de ADN de ciertas regiones microbianas o cribado computacional de datos de secuencia no enriquecidos contra conjuntos de datos del microbioma humano . Estos enfoques ofrecen mejoras, pero siguen estando sesgados en los taxones bacterianos utilizados para las asignaciones a nivel de especie. ^{[ 10 ]}

La herramienta de alineación MEGAN (MALT) es un nuevo programa para la alineación rápida y la asignación taxonómica en la identificación de ADN antiguo. MALT es similar a BLAST , ya que calcula alineaciones locales entre secuencias altamente conservadas y referencias. MALT también puede calcular alineaciones semiglobales, donde las lecturas se alinean de extremo a extremo. Todas las referencias, genomas bacterianos completos, se encuentran en la base de datos RefSeq del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). MALT consta de dos programas: malt-build y malt-run. Malt-build se utiliza para construir un índice para la base de datos de secuencias de referencia. Por otro lado, malt-run se utiliza para alinear un conjunto de secuencias de consulta con la base de datos de referencia. El programa calcula la puntuación de bits y el valor esperado (valor E) de la alineación y decide si conservarla o descartarla según los umbrales especificados por el usuario para la puntuación de bits, el valor E o el porcentaje de identidad. La puntuación de bits es el tamaño mínimo de una base de datos de secuencias en la que la coincidencia actual podría encontrarse por casualidad. Cuanto mayor sea la puntuación de bits, mayor será la similitud de la secuencia. El valor E es el número de coincidencias esperadas de calidad (puntuación) similar que podrían encontrarse por casualidad. Cuanto menor sea el valor E, mejor será la coincidencia. ^{[ 10 ]}

MALT permite el cribado de datos de secuencias no enriquecidas en la búsqueda de patógenos bacterianos candidatos desconocidos implicados en brotes de enfermedades pasadas y para la exclusión del fondo bacteriano ambiental. MALT es muy importante porque ofrece la ventaja del cribado a nivel genómico sin la selección de un organismo objetivo en particular, evitando errores comunes en otros métodos de cribado. Para autenticar las asignaciones taxonómicas candidatas se necesitan alineaciones completas, pero el ADN objetivo suele estar presente en baja cantidad, por lo que un pequeño número de una región marcada puede no ser suficiente para la identificación. Este método solo puede detectar ADN bacteriano y ADN viral, por lo que no es posible identificar otros agentes infecciosos que puedan estar presentes en una población. Este método es útil para estudios que abordan la identificación de patógenos responsables de enfermedades antiguas y modernas, especialmente en casos para los que no se conocen a priori los organismos candidatos . ^{[ 10 ]}

Una aplicación interesante de las diferentes técnicas de secuenciación disponibles hoy en día es la investigación de brotes históricos de enfermedades para dar respuesta a preguntas importantes y de larga data en epidemiología, evolución de patógenos y también historia humana. ^{[ 2 ]}

Por ello, se dedica mucho esfuerzo a encontrar cada vez más información sobre la etiología de enfermedades infecciosas de importancia histórica, como la peste y la epidemia de cocoliztli , a describir la propagación geográfica de los virus y a intentar definir el mecanismo patogénico de estos agentes infecciosos que son, en realidad, elementos activos del proceso evolutivo. Hoy en día, Y. pestis y S. enterica parecen ser inofensivas para los humanos, pero los científicos siguen interesados ​​en el seguimiento a largo plazo de la adaptación genética de estas bacterias y en la cuantificación precisa de las tasas de su cambio evolutivo. Esto se debe a que pueden extraer de este conocimiento del pasado las ideas adecuadas para desarrollar una estrategia contra futuras epidemias. ^{[ 2 ]}

Conscientes de que las bacterias y los virus son elementos sumamente variables en la naturaleza, propensos a mutaciones ilimitadas, y asumiendo que es imposible controlar todos los factores externos que influyen en el desarrollo de un virus patógeno, nadie habla de erradicar un posible nuevo brote de peste o de cualquier otro agente infeccioso del pasado: el objetivo es definir una estrategia, una guía, para estar mejor preparados ante la aparición de un nuevo patógeno peligroso. Es necesario definir la influencia del entorno en las infecciones, y factores como la migración humana, el cambio climático, el hacinamiento en las ciudades o la domesticación animal son algunas de las principales causas que contribuyen a la aparición y propagación de enfermedades. Por supuesto, estos factores son impredecibles, razón por la cual los investigadores buscan recuperar información relevante del pasado que pueda ser útil hoy y mañana. Mientras desarrollan estrategias para combatir las amenazas emergentes mediante herramientas diagnósticas, moleculares y avanzadas, siguen analizando cómo los patógenos antiguos evolucionaron y se adaptaron a través de eventos históricos. Cuanto más se conozca la base genómica de la virulencia en enfermedades históricas, mejor se podrá comprender la aparición y reaparición de enfermedades infecciosas en la actualidad y en el futuro. ^{[ 2 ]}

Los análisis de las relaciones filogenéticas entre el huésped humano y los patógenos virales sugieren que muchas enfermedades han coevolucionado con los humanos durante milenios, desde los inicios de la historia humana en África.

En particular, la interacción a largo plazo con patógenos se considera una selección que puede ser muy fuerte, ya que no todos los individuos podrían sobrevivir al contacto con todos los agentes infecciosos con los que se han encontrado a lo largo de los años: la selección natural por patógenos está implicada en la evolución de las especies. Esta interacción ya se ha utilizado para rastrear los movimientos de poblaciones humanas y reconstruir los flujos migratorios humanos dentro y fuera de África. ^{[ 11 ]}

Una aplicación e interpretación bastante novedosa de esta característica consiste en utilizar el ADN antiguo para comprender mejor la evolución humana. Muchas infecciones tropicales probablemente desempeñaron un papel significativo en el proceso evolutivo humano. La correlación entre humanos y virus puede entenderse si se considera como una "lucha" que continúa durante milenios y que aún no ha sido ganada por nadie: cuando los virus modificaron sus características para ser infecciosos para otros "combatientes", los humanos tuvieron que encontrar una estrategia para aumentar su aptitud y sobrevivir en medio de los cambios. ^{[ 11 ]}

En este desafío constante a lo largo de los años, junto con las enfermedades infecciosas y otras dolencias que afectan a la sociedad humana moderna, el cáncer representa actualmente una de las afecciones más enigmáticas. Los científicos investigan si las enfermedades neoplásicas se limitan a la sociedad humana postindustrial o si sus orígenes se remontan a épocas más antiguas, quizás a la prehistoria. La dificultad radica en que el cáncer, letal y de rápida evolución, deja muy pocos indicios en los esqueletos de quienes fallecen poco después, e incluso ningún rastro en el caso de tumores extraesqueléticos. En cualquier caso, el conocimiento sobre la etiología del cáncer es incompleto y los microorganismos desempeñan un papel importante a través de sus infecciones: las migraciones del pasado podrían haber traído consigo virus, posibles reservorios de enfermedades tropicales y predisposición al cáncer. Por este motivo, se aplican técnicas de análisis molecular a restos arqueológicos para estudiar la evolución de los homininos, pero también para mejorar la investigación sobre la epidemiología y la etiología de los tumores. La información derivada del ADN antiguo puede utilizarse para anclar mutaciones patógenas y reconstruir, a partir de la presencia de microorganismos, el proceso evolutivo; puede ser útil para desarrollar nuevas vacunas o descubrir posibles amenazas patógenas futuras. ^{[ 11 ]}

Yersinia pestis se distingue de las otras dos especies por su patogenicidad y mecanismo de transmisión. Estas diferencias se deben a dos plásmidos: pPCP1, que confiere a la bacteria sus propiedades invasivas en humanos, y pMT1, que interviene en la colonización por pulgas (junto con cierta pérdida de función en genes cromosómicos bacterianos).

Las muestras datadas en el Neolítico tardío y la Edad del Bronce permitieron identificar una primera divergencia genética entre los ancestros de Y. pseudotuberculosis y Y. pestis . Las características que confieren a Y. pestis su virulencia estaban ausentes en estas cepas: carecen de ymt , un gen necesario para la colonización del vector; además, presentaban una forma activa de genes requeridos para la formación de biopelículas (inactivos en el patógeno Y. pestis ) y un gen de flagelina activo , que es un inductor de la respuesta inmune (es un pseudogén en Y. pestis ). ^{[ 1 ]}

La comparación de un borrador del genoma y los dos plásmidos (pCD1 y pMT1) con muestras de víctimas de la Peste Negra (1348-1349) en el cementerio de East Smithfield puso de manifiesto una conservación genética muy alta de la secuencia: solo 97 diferencias de un solo nucleótido en 660 años. ^{[ 14 ]}

La cepa individual London 6330 posee mutaciones ausentes en otros aislamientos del mismo período (1348–1350): la razón puede ser la presencia de múltiples cepas circulando en Europa al mismo tiempo o la microevolución de una sola cepa durante la pandemia. ^{[ 14 ]}

Existen tres brotes pandémicos de Y. pestis :

1. La primera se conoce como la Peste de Justiniano; se originó en Egipto entre 541 y 543 y posteriormente se extendió a Constantinopla y las regiones vecinas. Tuvo brotes en Europa hasta el año 750 d. C. El análisis filogenético reveló que ambos genomas pertenecen a un linaje extinto en la actualidad y que está estrechamente relacionado con cepas de la China moderna, lo que sugiere la posibilidad de un origen en Asia Oriental para la primera pandemia.
2. La segunda pandemia se conoce como la Peste Negra o la Gran Pestilencia. Ocurrió en Europa entre 1346 y 1352 y tuvo numerosos rebrotes, prolongándose hasta el siglo XVIII. Es posible que durante esta pandemia coexistieran dos cepas diferentes de Yersinia pestis que ingresaron al continente a través de distintos brotes.
3. La tercera pandemia comenzó en China en 1860. Se propagó rápidamente a otros países debido al uso de ferrocarriles y barcos de vapor.

Las cepas asociadas a la peste de Justiniano aparecen en una rama novedosa, filogenéticamente distinta de la segunda y la tercera pandemia de peste. La primera cepa de Y. pestis hallada durante el segundo brote sobrevive y da origen a las cepas modernas de la rama 1 asociadas al tercer brote pandémico.

La primera bacteria de la peste y la segunda y tercera cepa de la peste tienen un ancestro común. ^{[ 2 ]}

En un estudio reciente, ^{[ 15 ]} los genomas de Y. pestis de tres muestras resumidas en Barcelona (fallecidos entre 1300 y 1420), Ellwangen (entre 1486 y 1627) y la ciudad de Bolgar (entre 1298 y 1388). La fecha de muerte de los individuos analizados se determinó gracias a las fechas de radiocarbono ; la última se confirmó por la presencia de una moneda producida solo después del año 1362. De 223 muestras de 178 individuos, solo una por cada sitio tenía una cantidad adecuada de ADN y finalmente fue seleccionada para la secuenciación del genoma completo del bacilo (a través de un ensayo de captura de genoma, utilizando como borrador el genoma de Y. pseudotuberculosis y pMT1 y pCD1 de Y. pestis ).

La alineación con un árbol filogenético de Y. pestis creado con genomas antiguos previamente conocidos reveló un aumento de la diversidad genética fuera de China en comparación con lo que se pensaba anteriormente; los tres nuevos genomas mapeados en la Rama 1 poseen dos SNP asociados a la Peste Negra (todos los genomas de Y. pestis datados en el mapa de la Peste Negra en la Rama 1). ^{[ 14 ]} La cepa de Barcelona no tiene diferencias con la cepa de Londres; los dos individuos de los que se obtuvo el genoma murieron de peste con una diferencia de algunos meses (primavera y otoño de 1348 ^{[ 16 ] [ 17 ]} ) subrayando la presencia en Europa de una sola ola de peste con baja diversidad genética. La cepa de Ellwangen se mapea en una subrama de la Rama 1 y es ancestral a una cepa previamente secuenciada (L'Observance). ^{[ 18 ]} Desciende de la que circulaba en Londres y Barcelona durante la Peste Negra pero también tiene mutaciones adicionales. Por lo tanto, se considera un linaje que se separó de la Rama 1 antes del siglo XVI (brote de Ellwangen) y sin descendientes modernos conocidos. ^{[ 15 ]}

En comparación con los aislados de la Peste Negra, la cepa de la ciudad de Bolgar presenta:

• p3 y p4, compartidas por el "individuo londinense 6330";
• p6, compartido con todas las cepas modernas de la Rama 1;
• p7, único de esta cepa;

La cepa de la ciudad de Bolgar posee SNP asociados a la Peste Negra y puede ser evidencia de un movimiento de la peste hacia el este; estos hallazgos respaldan uno de los modelos que intentan explicar el vínculo entre la segunda y la tercera pandemia: en este escenario, hubo una única salida de la peste a Europa (que causó la Peste Negra) que, tras un evento de radiación, viajó hacia el este para establecerse en la antigua Unión Soviética y Asia, desde donde se propagó en el siglo XVIII para dar origen a la tercera pandemia. ^{[ 15 ]}

Otra hipótesis plantea que el linaje de la tercera pandemia pudo haberse generado a partir de una variabilidad genética preexistente en cepas de Y. pestis en China: esta hipótesis se ve respaldada por la correlación entre las oleadas posteriores de la pandemia en Europa y las fluctuaciones climáticas que habrían permitido su propagación en el continente. Este modelo no puede explicar la diversidad genética de la Peste Negra (al menos cuatro linajes diferentes, lo que habría requerido la introducción desde Asia de cuatro cepas distintas). ^{[ 19 ]}

Nuevamente, existen dos modelos que intentan explicar los múltiples brotes de peste en Europa tras la peste negra:

• Introducción repetida de la peste desde Asia. Este escenario es compatible con la segunda teoría discutida anteriormente que ve una variabilidad genética de Y. pestis en China; ^{[ 20 ]}
• Presencia en Europa de un reservorio (ahora extinto) que provocó brotes continuos hasta el siglo XVIII;

Ambos modelos pueden ser válidos y, actualmente, no podemos demostrar la superioridad de uno sobre el otro. Sin embargo, el genoma de la cepa Ellwangen secuenciado en este estudio puede considerarse una prueba de la segunda hipótesis debido a la posición geográfica de la ciudad, que tiende a excluir la posibilidad de una introducción de la peste desde el este. ^{[ 15 ]}

La secuenciación de los genomas de Y. pestis permitió descubrir un evento de variación que precedió a la Peste Negra y que dio origen a muchas cepas que circulan hoy en día. ^{[ 15 ]}

Los científicos extrajeron el ADN antiguo de los dientes de 24 individuos indígenas, procedentes del cementerio epidémico de la época de contacto, y de 5 individuos enterrados en el cementerio de la época precolombina. La extracción se realizó siguiendo el protocolo establecido para la extracción de ADN antiguo. Paralelamente, el grupo de investigadores examinó también una muestra de suelo de los cementerios para obtener una visión general de los microorganismos ambientales que podrían haber contaminado las muestras.

Tras la extracción, los genomas se secuenciaron utilizando el analizador de genomas Illumina. Posteriormente, mediante la herramienta bioinformática MALT, los investigadores analizaron los datos de secuencias metagenómicas . Este programa permite alinear las secuencias extraídas con una referencia sin necesidad de especificar un objetivo preciso. Los investigadores ejecutaron MALT dos veces: una utilizando los genomas bacterianos completos disponibles en RefSeq del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) como referencia, y la segunda utilizando la base de datos completa de nucleótidos del NCBI para detectar ADN viral.

El resultado del análisis de detección fue positivo para la presencia de ADN de Salmonella enterica en 10 secuencias de un total de 24 recolectadas de las muestras, y tres muestras dentales presentaron una alta cantidad de lecturas asignadas a S. enterica . En particular, la cepa principal de S. enterica presente en las muestras es S. Paratyphi C. Esta cepa causa fiebre entérica en humanos. En las muestras de la época precolombina, no se encontró evidencia de S. enterica , lo que respalda la hipótesis de que S. enterica no era una bacteria local.

Se realizó un análisis adicional para identificar el patrón clásico de daño del ADN antiguo en las tres muestras dentales positivas, mediante el mapeo de los conjuntos de datos al genoma de referencia de S. Paratyphy C. Los resultados fueron positivos y respaldaron la hipótesis de que S. enterica es la causante de la cocolitzli.

Para profundizar en los análisis y confirmar la tesis, los investigadores realizaron experimentos y análisis computacionales adicionales. Llevaron a cabo un análisis de secuenciación de genoma completo y una hibridación en solución utilizando sondas que incluyen las diferencias del genoma de S. enterica moderno y utilizando S. Paratyphi C como referencia. La hibridación fue exitosa para las diez muestras positivas, mientras que las demás resultaron negativas para el ADN antiguo. ^{[ 10 ]}