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Anti-CRISPR

Anti-CRISPR (Anti-Agrupado Regularmente Interespaciado Repeticiones Palindrómicas Cortas o Acr) es un grupo de proteínas que se encuentran en los fagos y que inhiben la activida...

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Anti-CRISPR (Anti-Agrupado Regularmente Interespaciado Repeticiones Palindrómicas Cortas o Acr) es un grupo de proteínas que se encuentran en los fagos y que inhiben la actividad normal de CRISPR -Cas, el sistema inmunitario de ciertas bacterias . [ 1 ] CRISPR consiste en secuencias genómicas que se encuentran en organismos procariotas , provenientes de bacteriófagos que infectaron previamente a las bacterias, y se utilizan para defender a la célula de futuros ataques virales. [ 2 ] Anti-CRISPR es el resultado de un proceso evolutivo ocurrido en los fagos para evitar que sus genomas sean destruidos por las células procariotas que infectarán. [ 3 ]

Antes del descubrimiento de este tipo de proteínas familiares, la adquisición de mutaciones era la única forma conocida que los fagos podían usar para evitar la fragmentación mediada por CRISPR-Cas , al reducir la afinidad de unión entre el fago y CRISPR. No obstante, las bacterias poseen mecanismos para redirigir el bacteriófago mutante, un proceso que se denomina "adaptación por cebado". Por lo tanto, hasta donde saben actualmente los investigadores, la anti-CRISPR es la forma más eficaz de asegurar la supervivencia de los fagos durante el proceso de infección bacteriana. [ 4 ]

Historia

Los sistemas anti-CRISPR se observaron por primera vez en profagos de Pseudomonas aeruginosa , [ 5 ] que desactivaban el sistema CRISPR-Cas de tipo IF, característico de algunas cepas de estas bacterias. Tras analizar las secuencias genómicas de estos fagos, se descubrieron genes que codificaban cinco proteínas anti-CRISPR diferentes (también llamadas Acrs). Dichas proteínas eran AcrF1 , AcrF2 , AcrF3 , AcrF4 y AcrF5 . La investigación reveló que ninguna de estas proteínas interrumpía la expresión de los genes Cas ni el ensamblaje de las moléculas CRISPR, por lo que se pensó que estas proteínas de tipo IF afectaban directamente la interferencia CRISPR-Cas. [ 6 ]

Una investigación posterior confirmó esta hipótesis con el descubrimiento de otras 4 proteínas ( AcrE1 , AcrE2 , AcrE3 y AcrE4 ), que demostraron impedir el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa.sistema CRISPR-Cas. [ 7 ] Además, el locus de los genes que codifican estas proteínas de tipo IE estaba muy cerca del responsable de la expresión de las proteínas de tipo IF en el mismo grupo de fagos, lo que llevó a la conclusión de que ambos tipos de proteínas trabajaban juntas. [ 8 ]  Sin embargo, estas primeras nueve proteínas no compartían motivos de secuencia comunes , lo que habría facilitado la identificación de nuevas familias de proteínas Anti-CRISPR.

Posteriormente, se observó que los fagos que producían dichas proteínas también codificaban un supuesto regulador transcripcional denominado Aca 1 (anti-CRISPR associated 1), cuya ubicación genética era muy cercana a los genes anti-CRISPR. Se cree que esta proteína reguladora es responsable de la expresión del gen anti-CRISPR durante el ciclo infeccioso del fago; por lo tanto, ambos tipos de proteínas (anti-CRISPR y Aca1) parecen funcionar conjuntamente como un único mecanismo. [ 5 ]

Después de algunos estudios, se encontró una secuencia de aminoácidos similar a la de Aca1, lo que llevó al descubrimiento de Aca2 , una nueva familia de proteínas Aca. Aca2 también reveló la existencia de cinco nuevos grupos de proteínas anti-CRISPR de tipo IF debido a su proximidad genómica: AcrF6 , AcrF7 , AcrF8 , AcrF9 y AcrF10 . Estas proteínas no solo estaban presentes en Pseudomonas aeruginosafagos de , ya que también afectaban a otras células de los Pseudomonadota (anteriormente Proteobacteria ). [ 6 ]

Gracias al uso de herramientas bioinformáticas, en 2016 se descubrieron las familias de proteínas AcrIIC1 , AcrIIC2 y AcrIIC3 en Neisseria meningitidis (que había sido infectada previamente por fagos). Estas proteínas fueron los primeros inhibidores de CRISPR-Cas de tipo II que se encontraron (concretamente, impedían CRISPR-Cas9 de tipo II-C, el tipo de mecanismo utilizado en la edición genética de células humanas). [ 9 ] Un año después, un estudio confirmó la presencia de inhibidores de CRISPR-Cas9 de tipo II-A ( AcrIIA1 , AcrIIA2 , AcrIIA3 y AcrIIA4 ) en Listeria monocytogenes (infectada por bacteriófagos que introdujeron las proteínas anti-CRISPR). Se demostró que dos de esas proteínas (AcrIIA2 y AcrIIA4) funcionaban correctamente contra el sistema CRISPR defensivo de tipo II-A de Streptococcus pyogenes .

Si bien se conocían bien las bases mecanísticas de muchas proteínas Acr contra otros sistemas CRISPR, solo unas pocas proteínas anti-CRISPR contra el sistema CRISPR complejo III-A habían sido bien caracterizadas antes del descubrimiento de AcrIIIA2, codificada por el fago SW3 de Streptococcus thermophilus . Mediante herramientas bioinformáticas, se analizaron fagos que infectan especies de Streptococcus con un método de asociación de patrones. Adyacente al gen que codifica la proteína anti-CRISPR AcrIIA6, previamente conocida contra los sistemas CRISPR de tipo II-A, se descubrió una proteína anti-CRISPR AcrIIIA2 contra el sistema Cas de tipo III-A. Esta proteína bloquea la región semilla del crRNA y, por lo tanto, la unión del ARN diana, al formar un complejo con la enzima enolasa de la bacteria huésped . Esto bloquea todas las funciones posteriores del sistema CRISPR de tipo III: escisión del ARN diana, escisión del ADN y síntesis de oligoadenilato cíclico. [ 10 ]

El resultado de toda esta investigación ha sido el descubrimiento de 21 familias diferentes de proteínas anti-CRISPR, a pesar de que podrían existir otros inhibidores debido al rápido proceso mutacional de los fagos. Por lo tanto, se necesita más investigación para desentrañar la complejidad de los sistemas anti-CRISPR.

Tipos

Los genes anti-CRISPR se pueden encontrar en diferentes partes del ADN del fago: en la cápside , la cola y en el extremo. Además, se ha descubierto que muchos MGE tienen dos o incluso tres genes Acr en un solo operón , lo que sugiere que podrían haberse intercambiado entre MGE. [ 11 ]

Como todas las proteínas, las proteínas de la familia Acr se forman mediante la traducción y transducción de genes, y su clasificación se basa en el tipo de sistema CRISPR-Cas que inhiben, debido a que cada proteína anti-CRISPR inhibe un sistema CRISPR-Cas específico. Si bien no se han descubierto muchas proteínas anti-CRISPR, estas son las que se han encontrado hasta ahora:

Hasta el momento, se han encontrado genes que codifican proteínas anti-CRISPR en miófagos , sifófagos , supuestos elementos conjugativos e islas de patogenicidad .

Se han realizado intentos para encontrar características genéticas comunes en el entorno de los genes anti-CRISPR, pero sin éxito. Sin embargo, se ha observado la presencia de un gen aca justo debajo de los genes anti-CRISPR. [ 11 ]

Las primeras familias de proteínas Acr que se descubrieron fueron AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 y AcrF5. [ 5 ] Estos inhibidores se encuentran principalmente en fagos de Pseudomonas , que son capaces de infectar a Pseudomonas aeruginosa que posee un sistema CRISPR-Cas de tipo I-F. Luego, en otro estudio, se descubrió que las familias de proteínas AcrE1, AcrE2, AcrE3 y AcrE4 también inhiben el sistema CRISPR-Cas de tipo I-F en Pseudomonas aeruginosa. [ 7 ]

Más tarde, se descubrió que las familias de proteínas AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 y AcrF10, que también eran capaces de inhibir el CRISPR-Cas de tipo I-F, eran muy comunes en los MGE de Pseudomonadota . [ 11 ]

Posteriormente se descubrieron los primeros inhibidores de un sistema CRISPR-Cas de tipo II: AcrIIC1, AcrIIC2 y AcrIIC3, que bloquean la actividad CRISPR-Cas9 de tipo II-C de Neisseria meningitidis . [ 9 ]

Finalmente, se encontraron AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 y AcrIIA4. Estas familias de proteínas tienen la capacidad de inhibir el sistema CRISPR-Cas de tipo II-A de Listeria monocytogenes . [ 12 ]

En cuanto a la nomenclatura de las proteínas de la familia Acr, se establece de la siguiente manera: primero, el tipo de sistema inhibido; luego, un valor numérico que indica la familia de proteínas; y finalmente, la fuente de la proteína anti-CRISPR específica. Por ejemplo, AcrF9 Vpa es activa contra el sistema CRISPR-Cas de tipo IF. Además, fue la novena proteína anti-CRISPR descrita para este sistema y está codificada en un elemento genético móvil integrado en el genoma de Vibrio parahaemolyticus .

Estructura

Como se ha expuesto anteriormente, existe un amplio espectro de proteínas anti-CRISPR, pero pocas de ellas han sido estudiadas en profundidad. Una de las Acr más estudiadas y mejor definidas es AcrIIA4, que inhibe Cas9, bloqueando así el sistema CRISPR-Cas II-A de Streptococcus pyogenes .

AcrIIA4

Estructura de AcrIIA4 obtenida con el software UCSF Chimera, [ 13 ] donde se cargó su archivo PDB. [ 14 ] Se asignaron diferentes colores a las cuatro estructuras secundarias distintas encontradas en esta proteína: azul para las hebras β, rojo para las hélices α, naranja para la hélice 3 10 y gris para los bucles. Originalmente, el archivo PDB contiene las 20 secuencias de menor energía (y por lo tanto, las más estables) superpuestas, una de las cuales se seleccionó aleatoriamente para crear la figura. [ 15 ]

La proteína se resolvió mediante resonancia magnética nuclear (RMN); contiene 87 residuos y su peso molecular es de 10,182 kDa. [ 14 ] AcrIIA4 contiene:

  • Tres hebras β antiparalelas (la primera, de los residuos 16 al 19; la segunda, del 29 al 33; y la tercera, del 40 al 44) forman una lámina β. Esto representa el 16,1% del número total de aminoácidos, ya que 14 de ellos forman las hebras β.
  • 3 hélices α (la primera, de 2 a 13 residuos; la segunda, de 50 a 59 residuos; y la tercera, de 68 a 85 residuos).
  • La hélice 1 3 10 se ubica entre las hebras β primera (β1) y segunda (β2), comenzando en el residuo 22 y terminando en el residuo 25. La parte helicoidal total está compuesta por 40 residuos, lo que representa el 50,6% de la proteína.
  • Bucles que unen las diferentes estructuras secundarias.

Existe una buena definición de las estructuras secundarias, ya que las tres hélices α se encuentran empaquetadas cerca de las tres hebras β. Sorprendentemente, entre la hebra β3 y las hélices α2 y α3, existe un núcleo hidrofóbico, originado por un grupo de cadenas laterales aromáticas que se atraen mediante interacciones no covalentes, como el apilamiento pi . Además, al ser una proteína ácida, existe una alta concentración de residuos con carga negativa en los bucles entre β3 y α2, entre α2 y α3, y en la primera parte de α3, lo que podría desempeñar un papel importante en la inhibición de Cas9, ya que las cargas negativas podrían imitar los fosfatos de los ácidos nucleicos. [ 15 ]

AcrF1

Por otro lado, existe otro Acr, AcrF1, que quizás no haya sido tan estudiado como el mencionado anteriormente, aunque se cuenta con una buena descripción de su estructura. Este inhibe el sistema IF CRISPR-Cas de Pseudomonas aeruginosa . Maxwell et al. [ 16 ] determinaron su estructura tridimensional mediante RMN.

La proteína contiene 78 residuos, [ 6 ] entre los cuales interactúan para formar estructuras secundarias. La estructura de AcrF1 está formada por dos hélices α antiparalelas y una lámina β, que contiene cuatro hebras β antiparalelas. Esta lámina β se ubica en el lado opuesto de la parte helicoidal α, lo que crea un núcleo hidrofóbico formado por 13 aminoácidos. También se pueden encontrar giros en diferentes partes de la proteína, por ejemplo, uniendo las hebras β. [ 16 ] [ 17 ]

Existen residuos de superficie que participan activamente en el sitio activo de AcrF1, dos de los cuales son tirosinas (Y6 y Y20) y el tercer aminoácido es un ácido glutámico (E31), ya que su mutación por una alanina provoca una disminución de 100 veces en la actividad de la proteína (con las mutaciones Y20A y E31A), y una disminución de 10⁷ veces cuando se muta Y6.

Las diferentes estructuras que forman la proteína crean una combinación extraña, ya que Maxwell et al. realizaron una búsqueda DALI para encontrar similitudes entre otras proteínas y no encontraron similitudes informativas. [ 16 ]

Función

Evitar la destrucción del ADN del fago

La función principal de las proteínas anti-CRISPR es interactuar con componentes específicos de los sistemas CRISPR-Cas, como las nucleasas efectoras , para evitar la destrucción del ADN del fago (por unión o escisión). [ 18 ]

Un fago introduce su ADN en una célula procariota. Generalmente, la célula detecta una secuencia conocida como "diana", que activa el sistema inmunitario CRISPR-Cas. Sin embargo, la presencia de una secuencia inicial (anterior a la diana) que codifica la formación de proteínas Acr evita la destrucción del fago. Las proteínas Acr se forman antes de que se lea la secuencia diana. De esta manera, el sistema CRISPR-Cas se bloquea antes de que pueda desarrollar una respuesta.

El procedimiento comienza con la transcripción del locus CRISPR a crRNA (ARN CRISPR). Los crRNA se combinan con proteínas Cas formando un complejo de ribonucleoproteínas llamado Cascada. Este complejo explora la célula para encontrar secuencias complementarias del crRNA. Cuando se encuentra esta secuencia, la nucleasa Cas3 se une a la Cascada y se corta el ADN diana del fago. Sin embargo, por ejemplo, cuando se encuentran AcrF1 y AcrF2 (proteínas anti-CRISPR), estas interactúan con Cas7f y Cas8f-Cas5f, respectivamente, impidiendo la unión al ADN del fago. Además, la unión entre AcrF3 y Cas3 impide el corte del ADN diana. [ 6 ]

Cooperación fago-fago: Las primeras infecciones por fagos pueden no ser capaces de obstaculizar la inmunidad CRISPR, pero las cooperaciones fago-fago potencian cada vez más la producción de Acr y la inmunosupresión del huésped, lo que incrementa la vulnerabilidad de la célula huésped a la reinfección y, finalmente, permite una infección y propagación exitosas de un segundo fago. Basado en una representación encontrada en la referencia 17. [ 18 ]

La mayoría de los genes Acr se encuentran junto a los genes asociados a anti-CRISPR (Aca), que codifican proteínas con un motivo de unión al ADN hélice-giro-hélice. Los genes Aca se conservan y los investigadores los utilizan para identificar genes Acr, pero la función de las proteínas que codifican no está del todo clara. El promotor asociado a Acr produce altos niveles de transcripción de Acr justo después de la inyección del ADN del fago en la bacteria y, posteriormente, las proteínas Aca reprimen la transcripción. Si esta no se reprimiera, la transcripción constante del gen sería letal para el fago. Por lo tanto, la actividad de Aca es esencial para asegurar su supervivencia. [ 19 ]

cooperación fago-fago

Además, se ha verificado que las bacterias con sistemas CRISPR-Cas aún son parcialmente inmunes a Acr. En consecuencia, las infecciones fágicas abortivas iniciales pueden no ser capaces de obstaculizar la inmunidad CRISPR, pero la cooperación entre fagos puede aumentar progresivamente la producción de Acr y promover la inmunosupresión, lo que podría producir un aumento en la vulnerabilidad de la célula huésped a la reinfección y, finalmente, permitir una infección exitosa y la propagación de un segundo fago. [ 18 ] Esta cooperación crea un punto de inflexión epidemiológico, en el que, dependiendo de la densidad inicial de Acr-fagos y la fuerza de la unión CRISPR/Acr, los fagos pueden ser eliminados u originar una epidemia de fagos (el número de bacteriófagos se amplifica). [ 20 ] [ 21 ]

Si los niveles iniciales de fagos son suficientemente altos, la densidad de huéspedes inmunodeprimidos alcanza un punto crítico donde hay más infecciones exitosas que fallidas. Entonces, comienza una epidemia. Si no se alcanza este punto, se produce la extinción de los fagos y los huéspedes inmunodeprimidos recuperan su estado inicial. [ 20 ] [ 21 ]

Evasión inmunitaria de fagos

Se ha hecho evidente que las proteínas Acr desempeñan un papel importante al permitir la evasión inmunitaria de los fagos, aunque todavía no está claro cómo la síntesis de proteínas anti-CRISPR puede superar el sistema CRISPR-Cas del huésped, que puede destruir el genoma del fago en cuestión de minutos después de la infección. [ 18 ]

Mecanismos

Diagrama que muestra el sistema CRISPR-Cas de tipo IF, así como los mecanismos de inhibición de tres anti-CRISPR de tipo IF. El complejo CRISPR de tipo IF está formado por 60 nucleótidos de crRNA y nueve proteínas Cas (el tipo de proteína se especifica con los números 5, 8, 7 y 6). AcrF1 se une a Cas7f, impidiendo el acceso del ADN diana a la guía de crRNA. AcrF2 interactúa tanto con Cas8f como con Cas7f, dificultando el acceso del ADN diana al sitio de unión. Finalmente, AcrF3 forma un homodímero , interactuando con Cas3 e impidiendo su contacto con el complejo Cascade. Basado en una representación de una revisión que se encuentra en las referencias a continuación. [ 22 ]

De todas las proteínas anti-CRISPR descubiertas hasta la fecha, solo se han descrito los mecanismos de acción de 15 de ellas. Estos mecanismos se pueden clasificar en tres tipos: interferencia en la carga del crRNA, bloqueo de la unión al ADN e inhibición de la escisión del ADN .

interferencia de carga de ARNr

El mecanismo de interferencia de carga de CrRNA (ARN CRISPR) se ha asociado principalmente con la familia de proteínas AcrIIC2. [ 23 ] Para bloquear la actividad de Cas9 , impide el ensamblaje correcto del complejo crRNA-Cas9.

bloqueo de la unión al ADN

Se ha demostrado que AcrIIC2 no es la única capaz de bloquear la unión al ADN. Existen otras 11 proteínas de la familia Acr que también pueden realizar esta función. Algunas de ellas son AcrIF1, AcrIF2 y AcrIF10, que actúan sobre diferentes subunidades del complejo efector Cascade del sistema CRISPR-Cas de tipo IF, impidiendo que el ADN se una al complejo. [ 24 ]

Además, AcrIIC3 previene la unión al ADN al promover la dimerización de Cas9 [ 23 ] [ 25 ] y AcrIIA2 imita al ADN, bloqueando así los residuos de reconocimiento PAM y, en consecuencia, previniendo el reconocimiento y la unión del dsDNA (ADN de doble cadena) . [ 26 ] [ 27 ]

prevención de la escisión del ADN

AcrE1, AcrIF3 y AcrIIC1 pueden prevenir la escisión del ADN diana. Mediante cristalografía de rayos X , se descubrió que AcrE1 se une a Cas3 asociada a CRISPR. [ 28 ] Asimismo, el análisis bioquímico y estructural de AcrIF3 mostró su capacidad de unirse a Cas3 como dímero para prevenir el reclutamiento de Cas3 al complejo Cascade. [ 24 ] [ 29 ] [ 30 ] Finalmente, gracias a estudios bioquímicos y estructurales de AcrIIC1, se descubrió que se une al sitio activo del dominio endonucleasa HNH en Cas9, lo que impide la escisión del ADN. De esta forma, convierte a Cas9 en un estado inactivo pero unido al ADN. [ 25 ]

Aplicaciones

La terapia con fagos podría utilizarse contra la resistencia a los antibióticos, ya que los bacteriófagos pueden matar bacterias y curar una infección.

Reducción de los efectos no deseados de CRISPR-Cas9

AcrIIA4 es una de las proteínas responsables de la inhibición del sistema CRISPR-Cas9, el mecanismo utilizado en la edición de células de mamíferos. La adición de AcrIIA4 en células humanas evita la interacción de Cas9 con el sistema CRISPR, reduciendo su capacidad para cortar el ADN. Sin embargo, diversos estudios han llegado a la conclusión de que añadirla en pequeñas proporciones después de la edición del genoma reduce el número de cortes fuera de objetivo en los sitios específicos donde interactúa Cas9, lo que hace que todo el sistema sea mucho más preciso. [ 26 ]

Evitar consecuencias ecológicas

Uno de los principales objetivos del uso de la tecnología CRISPR-Cas9 es la erradicación de enfermedades, algunas de las cuales se encuentran en vectores de enfermedades , como los mosquitos. Las proteínas anti-CRISPR pueden impedir la manipulación genética , lo que podría generar consecuencias inciertas y catastróficas en los ecosistemas . [ 31 ]

Detectar la presencia de Cas9 en una muestra.

La terapia con fagos es una buena alternativa al uso de antibióticos, pero algunas bacterias poseen sistemas CRISPR-Cas. Sin embargo, si los fagos tuvieran proteínas Acr, inhibirían el sistema inmunitario CRISPR-Cas e infectarían la célula. Al final del ciclo de reproducción del fago, que tiene lugar dentro de la bacteria, se liberarían nuevos fagos, provocando la lisis celular.

Para saber si una bacteria determinada sintetiza Cas9 y, por lo tanto, utiliza CRISPR-Cas9, o para detectar el uso accidental o no autorizado de este sistema, se puede utilizar AcrIIC1. Dado que la proteína mencionada se une a Cas9, se ha diseñado una plataforma microfluídica centrífuga para detectarla y determinar su actividad catalítica. [ 31 ]

Terapia con fagos

La resistencia a los antibióticos es un problema de salud pública en constante aumento debido al mal uso de estos fármacos. La fagoterapia consiste en la infección de bacterias mediante fagos, que son mucho más específicos y causan menos efectos secundarios que los antibióticos. Acrs podría inhibir el sistema CRISPR-Cas9 de algunas bacterias y permitir que estos fagos infecten las células bacterianas sin ser atacados por su sistema inmunitario. [ 31 ]

Véase también

Referencias

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