síntesis de genes artificiales

Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando bloques de construcción llamados fosforamiditas de nucleósidos . Estas pueden ser nucleósidos normales o modificados que poseen grupos protectores para evitar que sus grupos amino, hidroxilo y fosfato interactúen incorrectamente. Se añade una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5' y se añade una nueva base, y así sucesivamente. La cadena crece en dirección 3' a 5', lo cual es inverso a la biosíntesis. Al final, se eliminan todos los grupos protectores. Sin embargo, al ser un proceso químico, se producen varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga sea la secuencia de oligonucleótidos que se sintetiza, mayor será el número de defectos; por lo tanto, este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos . El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb ( pares de bases ) para un oligonucleótido con la calidad suficiente para su uso directo en una aplicación biológica. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede utilizar para aislar productos con la secuencia correcta. Mientras tanto, se puede sintetizar un gran número de oligonucleótidos en paralelo en chips genéticos . Para un rendimiento óptimo en los procedimientos posteriores de síntesis genética, deben prepararse individualmente y a mayor escala.

Por lo general, un conjunto de oligonucleótidos diseñados individualmente se crea en sintetizadores de fase sólida automatizados, se purifica y luego se conecta mediante hibridación específica y reacciones estándar de ligación o polimerasa . Para mejorar la especificidad de la hibridación de oligonucleótidos, el paso de síntesis se basa en un conjunto de enzimas ADN ligasa y polimerasa termoestables . Hasta la fecha, se han descrito varios métodos para la síntesis de genes, como la ligación de oligonucleótidos fosforilados superpuestos, ^{[ 2 ] [ 3 ]} el método Fok I ^{[ 4 ]} y una forma modificada de reacción en cadena de ligasa para la síntesis de genes. Además, se han descrito varios enfoques de ensamblaje por PCR . ^{[ 9 ]} Por lo general, emplean oligonucleótidos de 40-50 nucleótidos de longitud que se superponen entre sí. Estos oligonucleótidos están diseñados para cubrir la mayor parte de la secuencia de ambas hebras, y la molécula de longitud completa se genera progresivamente mediante PCR de extensión por solapamiento (OE), ^{[ 9 ]} PCR de adentro hacia afuera termodinámicamente equilibrada (TBIO) ^{[ 10 ]} o enfoques combinados. ^{[ 11 ]} Los genes sintetizados con mayor frecuencia varían en tamaño de 600 a 1200 pb, aunque se han creado genes mucho más largos mediante la unión de fragmentos previamente ensamblados de menos de 1000 pb. En este rango de tamaño, es necesario analizar varios clones candidatos y confirmar la secuencia del gen sintético clonado mediante métodos de secuenciación automatizados.

Además, dado que el ensamblaje del producto génico completo depende de la alineación eficiente y específica de oligonucleótidos monocatenarios largos, los parámetros críticos para el éxito de la síntesis incluyen regiones de secuencia extendidas que comprenden estructuras secundarias causadas por repeticiones invertidas, un contenido de GC extraordinariamente alto o bajo, o estructuras repetitivas. Por lo general, estos segmentos de un gen en particular solo pueden sintetizarse dividiendo el procedimiento en varios pasos consecutivos y un ensamblaje final de subsecuencias más cortas, lo que a su vez conlleva un aumento significativo en el tiempo y el trabajo necesarios para su producción. El resultado de un experimento de síntesis génica depende en gran medida de la calidad de los oligonucleótidos utilizados. Para estos protocolos de síntesis génica basados ​​en el recocido, la calidad del producto depende directa y exponencialmente de la corrección de los oligonucleótidos empleados. Alternativamente, después de realizar la síntesis génica con oligos de menor calidad, se debe realizar un mayor esfuerzo en el control de calidad posterior durante el análisis de clones, que generalmente se lleva a cabo mediante procedimientos estándar de clonación y secuenciación que consumen mucho tiempo. Otro problema asociado a todos los métodos actuales de síntesis genética es la alta frecuencia de errores de secuencia debido al uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. La frecuencia de errores aumenta con oligonucleótidos más largos y, como consecuencia, el porcentaje de producto correcto disminuye drásticamente a medida que se utilizan más oligonucleótidos. El problema de la mutación podría resolverse utilizando oligonucleótidos más cortos para ensamblar el gen. Sin embargo, todos los métodos de ensamblaje basados ​​en hibridación requieren que los cebadores se mezclen en un mismo tubo. En este caso, las superposiciones más cortas no siempre permiten una hibridación precisa y específica de los cebadores complementarios, lo que resulta en la inhibición de la formación del producto de longitud completa. El diseño manual de oligonucleótidos es un procedimiento laborioso y no garantiza la síntesis exitosa del gen deseado. Para un rendimiento óptimo de casi todos los métodos basados ​​en hibridación, se supone que las temperaturas de fusión de las regiones superpuestas son similares para todos los oligonucleótidos. La optimización necesaria de los cebadores debe realizarse utilizando programas especializados de diseño de oligonucleótidos. Hasta el momento, se han presentado varias soluciones para el diseño automatizado de cebadores para la síntesis genética. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

Para superar los problemas asociados con la calidad de los oligonucleótidos, se han desarrollado diversas estrategias elaboradas, empleando oligonucleótidos de pesca preparados por separado, ^{[ 15 ]} enzimas de unión a desajustes de la familia mutS ^{[ 16 ]} o endonucleasas específicas de bacterias o fagos. ^{[ 17 ]} Sin embargo, todas estas estrategias aumentan el tiempo y los costos de la síntesis de genes basada en el apareamiento de oligonucleótidos sintetizados químicamente.

La secuenciación masiva en paralelo también se ha utilizado como herramienta para analizar bibliotecas de oligonucleótidos complejas y permitir la recuperación de moléculas precisas. En un método, los oligonucleótidos se secuencian en la plataforma de pirosecuenciación 454 y un sistema robótico captura imágenes y selecciona perlas individuales que corresponden a la secuencia precisa. ^{[ 18 ]} En otro método, una biblioteca de oligonucleótidos compleja se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masiva en paralelo. Los cebadores dirigidos a las etiquetas permiten entonces la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR dial-out. ^{[ 19 ]}

Cada vez más, los genes se ordenan en conjuntos que incluyen genes funcionalmente relacionados o múltiples variantes de secuencia en un solo gen. Prácticamente todas las proteínas terapéuticas en desarrollo, como los anticuerpos monoclonales, se optimizan probando muchas variantes genéticas para mejorar su función o expresión. La optimización de codones tiene aplicaciones en el diseño de genes sintéticos y vacunas de ADN . Las herramientas recientes incluyen modelos de aprendizaje automático como ColiFormer, que utilizan características de secuencia para guiar la optimización de codones; una implementación abierta está disponible como un Hugging Face Space público. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

Si bien la síntesis tradicional de ácidos nucleicos solo utiliza 4 pares de bases: adenina , timina , guanina y citosina , la síntesis de oligonucleótidos en el futuro podría incorporar el uso de pares de bases no naturales, que son nucleobases diseñadas y sintetizadas artificialmente que no se encuentran en la naturaleza.

En 2012, un grupo de científicos estadounidenses liderado por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo había diseñado un par de bases no naturales (UBP). Los dos nuevos nucleótidos artificiales, o pares de bases no naturales (UBP), se denominaron d5SICS y dNaM . Técnicamente, estos nucleótidos artificiales, que contienen nucleobases hidrofóbicas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o par de bases en el ADN. En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un segmento de ADN circular, conocido como plásmido, que contenía pares de bases naturales TA y CG junto con el UBP de mejor rendimiento diseñado por el laboratorio de Romesberg, y lo insertaron en células de la bacteria común E. coli , que replicó con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético expandido a generaciones posteriores. Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de alga de apoyo que expresa un transportador de nucleótidos trifosfato , el cual importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a la bacteria E. coli . Posteriormente, las vías naturales de replicación bacteriana los utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS–dNaM.

La incorporación exitosa de un tercer par de bases representa un avance significativo hacia el objetivo de ampliar considerablemente el número de aminoácidos que puede codificar el ADN, pasando de los 20 aminoácidos existentes a un máximo teórico de 172, lo que amplía el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . ^{[ 22 ]} En el futuro, estos pares de bases no naturales podrían sintetizarse e incorporarse a oligonucleótidos mediante métodos de impresión de ADN.

Las endonucleasas son enzimas que reconocen y cortan segmentos de ácidos nucleicos y se utilizan para dirigir el ensamblaje del ADN. De los distintos tipos de enzimas de restricción, las de tipo II son las más comunes y utilizadas, ya que sus sitios de corte se encuentran cerca o dentro de sus sitios de reconocimiento. Por lo tanto, los métodos de ensamblaje mediados por endonucleasas aprovechan esta propiedad para definir las partes del ADN y los protocolos de ensamblaje.

Bioladrillos

El estándar de ensamblaje BioBricks fue descrito e introducido por Tom Knight en 2003 y se ha actualizado constantemente desde entonces. ^{[ 25 ]} Actualmente, el estándar BioBricks más utilizado es el estándar de ensamblaje 10, o BBF RFC 10. BioBricks define las secuencias de prefijo y sufijo necesarias para que una pieza de ADN sea compatible con el método de ensamblaje BioBricks, lo que permite la unión de todas las piezas de ADN que estén en formato BioBricks.

El prefijo contiene los sitios de restricción para EcoRI, NotI y XBaI, mientras que el sufijo contiene los sitios de restricción SpeI, NotI y PstI. Fuera de las regiones del prefijo y el sufijo, la parte de ADN no debe contener estos sitios de restricción. Para unir dos partes de BioBrick, uno de los plásmidos se digiere con EcoRI y SpeI, mientras que el segundo plásmido se digiere con EcoRI y XbaI. Los dos extremos cohesivos de EcoRI son complementarios y, por lo tanto, se hibridarán juntos, mientras que SpeI y XbaI también producen extremos cohesivos complementarios que también pueden ligarse. Como el plásmido resultante contiene las secuencias originales del prefijo y el sufijo, puede usarse para unirse con más partes de BioBricks. ^{[ 26 ]} Debido a esta propiedad, se dice que el estándar de ensamblaje de BioBricks es idempotente . Sin embargo, también habrá una secuencia de "cicatriz" (ya sea TACTAG o TACTAGAG) formada entre los dos BioBricks fusionados. Esto impide que BioBricks se utilice para crear proteínas de fusión, ya que la secuencia cicatriz de 6 pb codifica una tirosina y un codón de parada, lo que provoca que la traducción se interrumpa después de que se exprese el primer dominio, mientras que la secuencia cicatriz de 8 pb provoca un cambio de marco de lectura , impidiendo la lectura continua de los codones. Para ofrecer secuencias cicatriz alternativas que, por ejemplo, den una cicatriz de 6 pb, o secuencias cicatriz que no contengan codones de parada, se diseñaron otros estándares de ensamblaje como el Ensamblaje BB-2, el Ensamblaje BglBricks, el Ensamblaje Silver y el Ensamblaje de Friburgo. ^{[ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]}

Aunque el método más sencillo para ensamblar las piezas de BioBrick se describe anteriormente, también existen otros métodos de ensamblaje de uso común que ofrecen varias ventajas sobre el ensamblaje estándar. El ensamblaje de 3 antibióticos (3A) permite seleccionar el ensamblaje correcto mediante la selección de antibióticos, mientras que el ensamblaje de inserción amplificada busca superar la baja eficiencia de transformación observada en el ensamblaje 3A. ^{[ 31 ] [ 32 ]}

El estándar de ensamblaje BioBrick también ha servido de inspiración para el uso de otros tipos de endonucleasas en el ensamblaje de ADN. Por ejemplo, tanto el estándar iBrick como los estándares de ensamblaje de vectores HomeRun emplean endonucleasas de homing en lugar de enzimas de restricción de tipo II. ^{[ 33 ] [ 34 ]}

Ensamblaje de endonucleasa de restricción de tipo IIs

Algunos métodos de ensamblaje también utilizan endonucleasas de restricción de tipo IIs. Estas se diferencian de otras endonucleasas de tipo II en que cortan varios pares de bases lejos del sitio de reconocimiento. Como resultado, la secuencia sobrante puede modificarse para contener la secuencia deseada. Esto proporciona a los métodos de ensamblaje de tipo IIs dos ventajas: permite un ensamblaje sin dejar marcas y posibilita el ensamblaje de múltiples partes en un solo paso. Entre los métodos de ensamblaje que utilizan endonucleasas de tipo IIs se encuentran Golden Gate y sus variantes asociadas.

Clonación de Golden Gate

El protocolo de ensamblaje Golden Gate fue definido por Engler et al. en 2008 para establecer un método de ensamblaje de ADN que generara una construcción final sin secuencias de restricción, y que careciera además de los sitios de restricción originales. Esto permite expresar la proteína sin contener secuencias proteicas no deseadas que podrían afectar negativamente su plegamiento o expresión. Mediante la enzima de restricción BsaI, que produce un saliente de 4 pares de bases, se pueden utilizar hasta 240 secuencias únicas no palindrómicas para el ensamblaje. ^{[ 35 ]}

Diseño y ensamblaje de plásmidos

En la clonación Golden Gate, cada fragmento de ADN que se va a ensamblar se coloca en un plásmido, flanqueado por sitios de restricción BsaI orientados hacia el interior que contienen las secuencias de extremo sobresaliente programadas. Para cada fragmento de ADN, la secuencia de extremo sobresaliente 3' es complementaria al extremo sobresaliente 5' del siguiente fragmento de ADN corriente abajo. Para el primer fragmento, el extremo sobresaliente 5' es complementario al extremo sobresaliente 5' del plásmido de destino, mientras que el extremo sobresaliente 3' del último fragmento es complementario al extremo sobresaliente 3' del plásmido de destino. Este diseño permite ensamblar todos los fragmentos de ADN en una reacción de un solo paso (donde todos los reactivos se mezclan), con todos los fragmentos dispuestos en la secuencia correcta. Los constructos ensamblados con éxito se seleccionan detectando la pérdida de función de un casete de cribado que originalmente estaba en el plásmido de destino. ^{[ 35 ]}

Moclo y Golden Braid

El ensamblaje original de Golden Gate solo permite que se realice una única construcción en el vector de destino. Para permitir que esta construcción se utilice en una reacción posterior como vector de entrada, se diseñaron los estándares MoClo y Golden Braid. ^{[ 36 ]}

El estándar MoClo implica definir múltiples niveles de ensamblaje de ADN:

• 

  El estándar de ensamblaje MoClo permite que las construcciones Golden Gate se ensamblen posteriormente en niveles subsiguientes. En el ejemplo que se muestra aquí, cuatro genes ensamblados mediante el ensamblaje Golden Gate de nivel 1 se ensamblan en una construcción multigénica en un ensamblaje de nivel 2.

  

  El estándar de ensamblaje Golden Braid también se basa en el primer nivel del ensamblaje Golden Gate y ensambla niveles adicionales mediante un protocolo por pares. Cuatro vectores de destino de nivel uno (ensamblados mediante el ensamblaje Golden Gate) se ensamblan en dos vectores de destino de nivel 2, que luego se utilizan como vectores de entrada de nivel 3 para el vector de destino de nivel 3. Se utilizan enzimas de restricción alternas (BpiI para el nivel 2 y BsaI para el nivel 3).

  Los estándares de ensamblaje MoClo y Golden Braid son derivados del estándar de ensamblaje Golden Gate original.
  Nivel 1: El ensamblaje de nivel 1 es el ensamblaje estándar Golden Gate, y los genes se ensamblan a partir de sus componentes (partes de ADN que codifican elementos genéticos como UTR , promotores, sitios de unión al ribosoma o secuencias terminadoras ). Flanqueando el sitio de inserción de los vectores de destino de nivel 1 se encuentran un par de sitios de restricción BpiI de corte interno. Esto permite que estos plásmidos se utilicen como vectores de entrada para los vectores de destino de nivel dos.
• Nivel 2: El ensamblaje de nivel 2 implica el ensamblaje adicional de los genes ensamblados en el nivel 1 para formar construcciones multigénicas. Si se requiere un ensamblaje de nivel superior, se pueden agregar sitios de restricción BsaI de corte interno para flanquear los sitios de inserción. Estos vectores se pueden usar como vectores de entrada para construcciones de nivel superior.

Cada nivel de ensamblaje alterna el uso de sitios de restricción BsaI y BpiI para minimizar el número de sitios prohibidos, y el ensamblaje secuencial para cada nivel se logra siguiendo el diseño del plásmido Golden Gate. En general, el estándar MoClo permite el ensamblaje de una construcción que contiene múltiples unidades de transcripción, todas ensambladas a partir de diferentes partes de ADN, mediante una serie de reacciones Golden Gate de un solo recipiente. Sin embargo, una desventaja del estándar MoClo es que requiere el uso de "partes ficticias" sin función biológica, si la construcción final requiere menos de cuatro partes componentes. ^{[ 37 ]} El estándar Golden Braid por otro lado introdujo un estándar de ensamblaje Golden Gate por pares.

El estándar Golden Braid utiliza el mismo ensamblaje por niveles que MoClo, pero cada nivel solo implica el ensamblaje de dos fragmentos de ADN, es decir, un enfoque por pares. Por lo tanto, en cada nivel, se clonan pares de genes en un fragmento de destino con la secuencia deseada, y estos se ensamblan posteriormente de dos en dos en niveles sucesivos. Al igual que MoClo, el estándar Golden Braid alterna las enzimas de restricción BsaI y BpiI entre cada nivel.

El desarrollo de los métodos de ensamblaje Golden Gate y sus variantes ha permitido a los investigadores diseñar conjuntos de herramientas para acelerar el flujo de trabajo de la biología sintética. Por ejemplo, EcoFlex se desarrolló como un conjunto de herramientas para E. coli que utiliza el estándar MoClo para sus componentes de ADN, mientras que también se ha desarrollado un conjunto de herramientas similar para la ingeniería de la microalga Chlamydomonas reinhardtii . ^{[ 38 ] [ 39 ]}

Los vectores de entrada de Gateway Cloning deben producirse primero utilizando un fragmento de ADN sintetizado que contenga los sitios attB necesarios. La recombinación con el vector donante es catalizada por la mezcla de clonasa BP y produce el vector de entrada deseado con sitios attL.

La construcción deseada se obtiene mediante la recombinación del vector de entrada con el vector de destino. En este caso, la construcción final implica el ensamblaje de dos fragmentos de ADN de interés. Los sitios attL del vector de entrada se recombinan con los sitios attR del vector de destino. El gen letal ccdB se pierde del vector de destino, y cualquier bacteria que incorpore el vector no deseado morirá, lo que permite la selección del vector deseado.

El descubrimiento de sitios att ortogonales específicos (es decir, cada attL ortogonal reacciona únicamente con su ligando attR) permitió el desarrollo de la tecnología de clonación de puerta de enlace multisitio. Esta tecnología permite ensamblar múltiples fragmentos de ADN, cuyo orden está determinado por los sitios att.

Resumen de las principales tecnologías de clonación de pasarelas.

La recombinación sitio-específica utiliza integrasas de fagos en lugar de enzimas de restricción, eliminando la necesidad de tener sitios de restricción en los fragmentos de ADN. En cambio, las integrasas utilizan sitios de unión (att) únicos y catalizan el reordenamiento del ADN entre el fragmento diana y el vector de destino. El sistema de clonación Gateway de Invitrogen se inventó a finales de la década de 1990 y utiliza dos mezclas de enzimas patentadas: la clonasa BP y la clonasa LR. La mezcla de clonasa BP cataliza la recombinación entre los sitios attB y attP, generando sitios híbridos attL y attR, mientras que la mezcla de clonasa LR cataliza la recombinación de los sitios attL y attR para dar los sitios attB y attP. Como cada mezcla de enzimas reconoce solo sitios att específicos, la recombinación es altamente específica y los fragmentos se pueden ensamblar en la secuencia deseada. ^{[ 40 ]}

Diseño y ensamblaje vectorial

Dado que la clonación Gateway es una tecnología patentada, todas las reacciones Gateway deben realizarse con el kit Gateway proporcionado por el fabricante. La reacción se resume en dos pasos. El primer paso consiste en ensamblar los clones de entrada que contienen el fragmento de ADN de interés, mientras que el segundo paso consiste en insertar este fragmento de interés en el clon de destino.

1. Los clones de entrada deben crearse utilizando los vectores "Donantes" suministrados, que contienen un casete Gateway flanqueado por sitios attP. El casete Gateway contiene un gen suicida bacteriano (por ejemplo, ccdB ) que permitirá la supervivencia y selección de los clones de entrada recombinados con éxito. Se añaden dos sitios attB para flanquear el fragmento de ADN de interés, lo que permitirá la recombinación con los sitios attP al añadir la mezcla de clonasa BP. Se producen clones de entrada, y el fragmento de interés queda flanqueado por sitios attL.
2. El vector de destino también incluye un casete Gateway, pero flanqueado por dos sitios attR. Al mezclar este plásmido de destino con los clones de entrada y la mezcla de clonasa LR, se produce la recombinación entre los sitios attR y attL. Se genera un clon de destino con el fragmento de interés insertado correctamente. El gen letal se inserta en el vector original, y las bacterias transformadas con este plásmido mueren. De esta forma, se puede seleccionar fácilmente el vector deseado.

Las primeras versiones del método de clonación Gateway solo permitían utilizar un único clon de entrada para cada clon de destino producido. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que se podían generar cuatro secuencias att ortogonales adicionales, lo que permitía el ensamblaje de hasta cuatro fragmentos de ADN diferentes. Este proceso se conoce ahora como la tecnología Gateway multisitio. ^{[ 41 ]}

Además de la clonación Gateway, también se han desarrollado métodos no comerciales que utilizan otras integrasas. Por ejemplo, el método de ensamblaje recombinacional de integrasa de serina (SIRA) utiliza la integrasa ΦC31, mientras que el método de ensamblaje en tándem basado en recombinación sitio-específica (SSRTA) utiliza la integrasa φBT1 del fago de Streptomyces . ^{[ 42 ] [ 43 ]} Otros métodos, como el sistema de ensamblaje de vectores HomeRun (HVAS), se basan en el sistema de clonación Gateway e incorporan endonucleasas homing para diseñar un protocolo que podría potencialmente respaldar la síntesis industrial de construcciones de ADN sintético. ^{[ 33 ]}

En los últimos años se han desarrollado diversos métodos de ensamblaje basados ​​en solapamientos largos. Uno de los más utilizados, el método de ensamblaje de Gibson, se desarrolló en 2009 y proporciona un método de ensamblaje de ADN en un solo paso que no requiere el uso de enzimas de restricción ni integrasas. ^{[ 44 ]} Otros métodos de ensamblaje similares basados ​​en solapamientos incluyen la clonación por extensión de polimerasa circular (CPEC), la clonación independiente de secuencia y ligasa (SLIC) y el extracto de clonación por ligación sin fisuras (SLiCE). ^{[ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]} A pesar de la existencia de muchos métodos de ensamblaje por solapamiento, el método de ensamblaje de Gibson sigue siendo el más popular. ^{[ 48 ]} Además de los métodos mencionados anteriormente, otros investigadores han desarrollado, a partir de los conceptos utilizados en el ensamblaje de Gibson y otros métodos de ensamblaje, nuevas estrategias de ensamblaje, como la estrategia de ensamblaje modular dirigido por solapamiento con enlazadores (MODAL) o el método estándar de ensamblaje de biopartes para clonación idempotente (BASIC). ^{[ 49 ] [ 50 ]}

Ensamblaje Gibson

El método de ensamblaje de Gibson es un método de ensamblaje de ADN relativamente sencillo que requiere solo unos pocos reactivos adicionales: la exonucleasa 5' T5 , la ADN polimerasa Phusion y la ADN ligasa Taq . Los fragmentos de ADN que se van a ensamblar se sintetizan con extremos 5' y 3' superpuestos en el orden en que se van a ensamblar. Estos reactivos se mezclan con los fragmentos de ADN que se van a ensamblar a 50 °C y se producen las siguientes reacciones: 

1. La exonucleasa T5 degrada el ADN desde el extremo 5' de cada fragmento, dejando al descubierto extremos 3' sobresalientes en cada fragmento de ADN.
2. Los extremos cohesivos de los fragmentos de ADN adyacentes se unen mediante el apareamiento de bases complementarias.
3. La ADN polimerasa Phusion rellena los huecos que quedan donde se unen los fragmentos.
4. La ADN ligasa Taq repara las roturas en ambas hebras de ADN.

Debido a que la exonucleasa T5 es termolábil, se inactiva a 50  °C después del paso inicial de degradación. Por lo tanto, el producto es estable y los fragmentos se ensamblan en el orden deseado. Este protocolo de un solo paso puede ensamblar hasta 5 fragmentos diferentes con precisión, mientras que varios proveedores comerciales ofrecen kits para ensamblar con precisión hasta 15 fragmentos diferentes en una reacción de dos pasos. ^{[ 51 ]} Sin embargo, si bien el protocolo de ensamblaje de Gibson es rápido y utiliza relativamente pocos reactivos, requiere una síntesis de ADN a medida, ya que cada fragmento debe diseñarse para contener secuencias superpuestas con los fragmentos adyacentes y amplificarse mediante PCR. Esta dependencia de la PCR también puede afectar la fidelidad de la reacción cuando se utilizan fragmentos largos, fragmentos con alto contenido de GC o secuencias repetidas. ^{[ 50 ]}

BÁSICO

La estrategia de ensamblaje BASIC se desarrolló en 2015 y buscaba abordar las limitaciones de las técnicas de ensamblaje anteriores, incorporando seis conceptos clave de ellas: piezas reutilizables estándar; formato de una sola capa (todas las piezas están en el mismo formato y se ensamblan utilizando el mismo proceso); clonación idempotente; ensamblaje de ADN paralelo (multiparte); independencia de tamaño; automatización. ^{[ 50 ]}

Diseño de componentes y conectores de ADN

Las partes de ADN se diseñan y clonan en plásmidos de almacenamiento, con la parte flanqueada por una secuencia de prefijo integrado ( i P) y una secuencia de sufijo integrado ( i S). Las secuencias i P e i S contienen sitios de restricción BsaI orientados hacia adentro, que contienen salientes complementarios a los enlazadores BASIC. ^{[ 50 ]} Al igual que en MODAL, los 7 enlazadores estándar utilizados en BASIC se diseñaron con el software R2oDNA Designer y se analizaron para asegurar que no contuvieran secuencias con homología a genomas de chasis, y que no contuvieran secuencias no deseadas como secuencias de estructura secundaria, sitios de restricción o sitios de unión ribosomal. Cada secuencia de enlazador se divide en dos mitades, cada una con un saliente de 4 pb complementario al sitio de restricción BsaI, una secuencia de doble cadena de 12 pb y compartiendo una secuencia de solapamiento de 21 pb con la otra mitad. La mitad que se une a la parte del ADN situada aguas arriba se conoce como segmento de enlace sufijo (p. ej., L1S), y la mitad que se une a la parte situada aguas abajo se conoce como segmento de enlace prefijo (p. ej., L1P). Estos segmentos de enlace constituyen la base para el ensamblaje de las partes del ADN.

Además de dirigir el orden de ensamblaje, los enlazadores BASIC estándar también pueden modificarse para realizar otras funciones. Para permitir el ensamblaje idempotente, se diseñaron enlazadores con secuencias i P e i S metiladas adicionales insertadas para protegerlas del reconocimiento por BsaI. Esta metilación se pierde tras la transformación y la replicación del plásmido in vivo, y los plásmidos pueden extraerse, purificarse y utilizarse en reacciones posteriores.

Debido a que las secuencias de enlace son relativamente largas (45 pb para un enlace estándar), existe la oportunidad de incorporar secuencias de ADN funcionales para reducir la cantidad de fragmentos de ADN necesarios durante el ensamblaje. El estándar de ensamblaje BASIC proporciona varios enlaces con sitios de unión al ribosoma (RBS) de diferente intensidad. Asimismo, para facilitar la construcción de proteínas de fusión con múltiples dominios proteicos, se diseñaron varios enlaces de fusión que permiten la lectura completa del ADN. Estos enlaces de fusión codifican un polipéptido de glicina y serina de 15 aminoácidos, un péptido de enlace ideal para proteínas de fusión con múltiples dominios.

Las secuencias de ADN que se utilizarán para el ensamblaje BASIC deben contener secuencias de prefijo y sufijo integradas (iP e iS). Estas secuencias contienen sitios de restricción BsaI que permiten la unión de los enlazadores iP e iS (que contienen secuencias complementarias de extremos salientes) a la secuencia de ADN. Una vez unidos los enlazadores, la secuencia está lista para el ensamblaje.

La secuencia de ensamblaje viene determinada por la posición de los enlazadores. El enlazador de sufijo se liga al extremo 3' del fragmento anterior, mientras que el enlazador de prefijo se liga al extremo 5' del fragmento posterior. Aquí se muestra un ejemplo de una construcción de ensamblaje BASIC que utiliza cuatro partes de ADN.

Asamblea

El montaje de la estructura final consta de tres pasos principales.

1. En primer lugar, se escinden las partes de ADN del plásmido de almacenamiento, obteniendo un fragmento de ADN con extremos salientes de BsaI en los extremos 3' y 5'.
2. A continuación, cada segmento de enlace se une a su respectivo segmento de ADN mediante incubación con la ligasa de ADN T4. Cada segmento de ADN tendrá un segmento de enlace de sufijo y otro de prefijo, provenientes de dos enlaces diferentes, para dirigir el orden de ensamblaje. Por ejemplo, el primer segmento de la secuencia tendrá unidos L1P y L2S, mientras que el segundo tendrá unidos L2P y L3S. Los segmentos de enlace pueden modificarse para cambiar la secuencia de ensamblaje.
3. Finalmente, las partes con los enlazadores unidos se ensamblan en un plásmido mediante incubación a 50  °C. Los extremos salientes de 21 pb de los enlazadores P y S se hibridan y la construcción final puede transformarse en células bacterianas para su clonación. Las muescas de cadena simple se reparan in vivo tras la transformación, lo que produce una construcción final estable clonada en plásmidos.

Como parte del proyecto Levadura Sintética 2.0, varios grupos de investigación de todo el mundo han participado en un proyecto para sintetizar genomas de levadura sintética y, a través de este proceso, optimizar el genoma del organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . ^{[ 58 ]} El proyecto Levadura 2.0 aplicó varios métodos de ensamblaje de ADN que se han comentado anteriormente, y en marzo de 2014, Jef Boeke del Centro Médico Langone de la Universidad de Nueva York reveló que su equipo había sintetizado el cromosoma III de S. cerevisiae . ^{[ 59 ] [ 60 ]} El procedimiento implicó reemplazar los genes del cromosoma original con versiones sintéticas y el cromosoma sintético terminado se integró en una célula de levadura. Requirió diseñar y crear 273.871 pares de bases de ADN, menos que los 316.667 pares del cromosoma original. En marzo de 2017, se había completado la síntesis de 6 de los 16 cromosomas, y la síntesis de los demás aún estaba en curso. ^{[ 61 ]}

Si la creación de ADN humano mediante síntesis genética artificial se volviera técnicamente factible, los investigadores han identificado varios problemas éticos y sociales ^{[ 62 ]} . Académicos como Adrian Villalba y Anna Smajdor han señalado que el ADN sintético podría poner en tela de juicio las suposiciones existentes sobre la naturaleza y la importancia del material genético humano. Un área de preocupación se refiere al concepto de propiedad genética. Si la secuencia de ADN de una persona puede recrearse artificialmente en el laboratorio, no queda claro quién posee los derechos o el control sobre el material resultante, ni si los marcos legales y éticos actuales son adecuados para abordar estos casos.

También surgen interrogantes sobre la identidad. Tradicionalmente, se ha considerado que los genomas humanos están estrechamente ligados a la identidad personal y la herencia biológica. Sin embargo, la posibilidad de reconstruir o rediseñar secuencias genómicas mediante ADN sintético debilitaría significativamente esta asociación. Si los genomas pueden crearse, modificarse o replicarse independientemente de la herencia natural, la idea de que la constitución genética determina de forma rígida los rasgos personales se vuelve cada vez más difícil de sostener. En este contexto, se propone que el ADN sintético socava eficazmente el determinismo genético e impulsa una reevaluación de las suposiciones sobre el papel de los genes en la configuración de la identidad individual.

La privacidad es otro tema importante. La posibilidad de sintetizar secuencias idénticas o similares a las de individuos existentes genera inquietudes sobre la protección de datos genéticos y su posible uso indebido. Las medidas de seguridad tradicionales para la información genética podrían no ser suficientes para abordar los escenarios en los que el ADN puede recrearse independientemente de una muestra biológica.

Esta tecnología también podría afectar los debates sobre reproducción y paternidad. Si se utilizan genomas sintéticos, gametos sintéticos o secuencias parcialmente sintetizadas en contextos reproductivos, podría resultar más difícil determinar la paternidad genética o aplicar regulaciones basadas en la descendencia biológica. Esto podría tener implicaciones para la reproducción asistida, el anonimato de los donantes y las definiciones legales de las relaciones familiares.

Trabajos teóricos adicionales sobre ADN sintético humano proponen una alternativa a las técnicas de reemplazo mitocondrial mediante el uso de ADN sintético para reconstruir orgánulos mitocondriales ^{[ 63 ]} . Al crear ADN mitocondrial de novo, este enfoque elimina la necesidad de un donante mitocondrial independiente en las intervenciones reproductivas. Los autores argumentan que este desarrollo socava la idea del llamado bebé de tres progenitores, ya que la secuencia mitocondrial ya no provendría de un tercer individuo. Además, la posibilidad de diseñar y reemplazar genomas mitocondriales por medios sintéticos debilita aún más el determinismo genético , puesto que elementos de la herencia biológica que antes se consideraban fijos pueden generarse independientemente del linaje natural.

La posibilidad de construir ADN humano sintético desde cero podría permitir a los individuos crear gametos que porten secuencias específicas de su propio material genético, en lugar de depender de la herencia natural o de gametos seleccionados al azar en la reproducción asistida. ^{[ 64 ]} . A diferencia de las técnicas tradicionales como la edición genética de embriones , que alteran directamente el genoma de un embrión existente y, por lo tanto, afectan a la persona, estos gametos sintéticos se construyen de novo y dan lugar a individuos que no habrían existido de otro modo, lo que hace que la intervención no afecte a la persona en el sentido de Parfit . Los gametos producidos de esta manera, que son distintos de los gametos artificiales obtenidos mediante gametogénesis derivada in vitro, plantean cuestiones éticas con respecto a la autonomía reproductiva, la identidad y el diseño de rasgos humanos sin afectar a personas preexistentes.