construcción de ADN

Un constructo de ADN es un segmento de ADN diseñado artificialmente y transportado en un vector que puede utilizarse para incorporar material genético en un tejido o célula diana . ^{[ 1 ]} Un constructo de ADN contiene un inserto de ADN , denominado transgén , que se introduce mediante un vector de transformación que permite la replicación y/o expresión de la secuencia del inserto en la célula diana. Este gen puede clonarse a partir de un gen natural, ^{[ 2 ]} o construirse sintéticamente. ^{[ 3 ]} El vector puede introducirse mediante métodos físicos, químicos o virales. ^{[ 4 ]} Normalmente, los vectores utilizados en los constructos de ADN contienen un origen de replicación , un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable . ^{[ 2 ]} Ciertos vectores pueden contener elementos reguladores adicionales en función del sistema de expresión utilizado. ^{[ 5 ]}

Las construcciones de ADN pueden ser tan pequeñas como unos pocos miles de pares de bases (kbp) de ADN que portan un solo gen, utilizando vectores como plásmidos o bacteriófagos , o tan grandes como cientos de kbp para estudios genómicos a gran escala utilizando un cromosoma artificial. ^{[ 2 ]} Una construcción de ADN puede expresar proteína de tipo silvestre, prevenir la expresión de ciertos genes mediante la expresión de competidores o inhibidores, o expresar proteínas mutantes, como mutaciones por deleción o mutaciones de sentido erróneo . Las construcciones de ADN se adaptan ampliamente en la investigación de biología molecular para técnicas como la secuenciación de ADN, la expresión de proteínas y los estudios de ARN. ^{[ 5 ]}

El primer vector estandarizado, pBR220, fue diseñado en 1977 por investigadores del laboratorio de Herbert Boyer. El plásmido contiene varios sitios de restricción para enzimas y un gen de resistencia a antibióticos estable, libre de la actividad de transposones. ^{[ 6 ]}

En 1982, Jeffrey Vieira y Joachim Messing describieron el desarrollo de vectores pUC derivados de M13mp7 que constan de un sitio de clonación múltiple y permiten una secuenciación y clonación más eficientes utilizando un conjunto de cebadores universales M13. Tres años después, el plásmido pUC19, actualmente muy popular, fue diseñado por los mismos científicos. ^{[ 7 ]}

El gen de interés en una secuencia de ADN puede clonarse a partir de una secuencia existente o desarrollarse sintéticamente. Para clonar una secuencia natural en un organismo, primero se corta el ADN del organismo con enzimas de restricción , que reconocen secuencias de ADN y las cortan alrededor del gen diana. Posteriormente, el gen se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Normalmente, este proceso incluye el uso de secuencias cortas, conocidas como cebadores, que se hibridan inicialmente con la secuencia diana; además, se pueden introducir mutaciones puntuales en las secuencias de los cebadores y copiarlas en cada ciclo para modificar la secuencia diana. ^{[ 2 ]}

También es posible sintetizar una cadena de ADN objetivo para una construcción de ADN. Se pueden desarrollar cadenas cortas de ADN conocidas como oligonucleótidos mediante síntesis en columna, en la que las bases se añaden una a una a una cadena de ADN unida a una fase sólida. Cada base tiene un grupo protector para evitar la unión, que no se elimina hasta que la siguiente base esté lista para ser añadida, asegurando así que se unan en la secuencia correcta. Los oligonucleótidos también se pueden sintetizar en un microarreglo, lo que permite sintetizar decenas de miles de secuencias a la vez, con el fin de reducir costes. ^{[ 3 ]} Para sintetizar un gen más grande, se desarrollan oligonucleótidos con secuencias superpuestas en los extremos y luego se unen. El método más común se denomina ensamblaje por ciclo de polimerasa (PCA): los fragmentos se hibridan en las regiones superpuestas y se extienden, y se crean fragmentos más grandes en cada ciclo. ^{[ 2 ]}

Una vez aislada una secuencia, debe insertarse en un vector . La forma más sencilla de hacerlo es cortar el ADN del vector con enzimas de restricción; si se usaron las mismas enzimas para aislar la secuencia diana, se crearán secuencias "sobresalientes" idénticas en ambos extremos, lo que permitirá la hibridación. Una vez que el gen diana se ha hibridado con el ADN del vector, se pueden unir mediante una ADN ligasa . ^{[ 2 ]} Una estrategia alternativa utiliza la recombinación entre sitios homólogos del gen diana y la secuencia del vector, eliminando la necesidad de enzimas de restricción. ^{[ 8 ]}

Existen tres categorías generales de administración de construcciones de ADN: físicas, químicas y virales. ^{[ 4 ]} Los métodos físicos, que administran el ADN penetrando físicamente la célula, incluyen la microinyección , la electroporación y la biolística . ^{[ 9 ]} Los métodos químicos se basan en reacciones químicas para administrar el ADN e incluyen la transformación con células competentes mediante fosfato de calcio, así como la administración a través de nanopartículas lipídicas. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Los métodos virales utilizan una variedad de vectores virales para administrar el ADN, incluidos el adenovirus , el lentivirus y el virus del herpes simple . ^{[ 12 ]}

Además del gen diana, un vector contiene tres elementos importantes: un origen de replicación, un marcador seleccionable y un sitio de clonación múltiple. El origen de replicación es una secuencia de ADN que inicia el proceso de replicación, permitiendo que el vector se clone. El sitio de clonación múltiple contiene sitios de unión para diversas enzimas de restricción, facilitando la inserción de diferentes secuencias de ADN en el vector. Un marcador seleccionable confiere una característica fácilmente seleccionable en la célula huésped, permitiendo determinar si la transformación fue exitosa. Los marcadores seleccionables más comunes son genes de resistencia a antibióticos, de modo que las células huésped sin el constructo mueren al exponerse al anticuerpo, y solo sobreviven las células con el constructo. ^{[ 2 ]}

• Los plásmidos bacterianos son fragmentos circulares de ADN que se replican naturalmente en las bacterias. ^{[ 2 ]} Los plásmidos pueden contener inserciones de hasta aproximadamente 20 kbp de longitud. Este tipo de construcciones suelen contener un gen que confiere resistencia a antibióticos, un origen de replicación, elementos reguladores como inhibidores de la lactosa , un polienlazador y una etiqueta proteica que facilita la purificación de la proteína. ^{[ 14 ]}
• Los vectores bacteriófagos son virus que pueden infectar bacterias y replicar su propio ADN. ^{[ 2 ]}
• Los cromosomas artificiales se utilizan comúnmente en estudios de proyectos genómicos debido a su capacidad para albergar inserciones de hasta 350 kbp. Estos vectores se derivan del plásmido F , aprovechando la alta estabilidad y capacidad de conjugación que introduce el factor F. ^{[ 15 ]}
• Los fosmidos son un híbrido entre los plásmidos bacterianos F y las técnicas de clonación de fagos λ. Los insertos se empaquetan previamente en partículas de fago y luego se insertan en la célula huésped, con capacidad para albergar aproximadamente 45 kbp. Se utilizan habitualmente para generar una biblioteca de ADN debido a su mayor estabilidad. ^{[ 16 ]}

Las construcciones de ADN pueden utilizarse para producir proteínas, tanto naturales como mutantes diseñadas. Estas proteínas pueden emplearse para elaborar productos terapéuticos, como fármacos y anticuerpos. Las construcciones de ADN también pueden modificar los niveles de expresión de otros genes mediante la expresión de secuencias reguladoras, como promotores e inhibidores. Además, pueden utilizarse en investigación, por ejemplo, para crear bibliotecas genómicas, secuenciar ADN clonado y estudiar la expresión de ARN y proteínas. ^{[ 5 ]}

• Vector (biología molecular)