BamHI

BamHI (pronunciado "Bam H one") (de Bacillus amyloliquefaciens ) es una endonucleasa de restricción de tipo II , con capacidad para reconocer secuencias cortas (6 pb) de ADN y cortarlas específicamente en un sitio diana . Esta exposición se centra en las relaciones estructura-función de BamHI, tal como las describieron Newman et al. (1995). BamHI se une a la secuencia de reconocimiento 5'-GGATCC-3' y corta estas secuencias justo después de la guanina 5' en cada hebra. Este corte produce extremos cohesivos de 4 pb de longitud. En su forma no unida, BamHI presenta una lámina b central , que se encuentra entre hélices α .

La enzima BamHI experimenta una serie de cambios conformacionales no convencionales al reconocer el ADN . Esto permite que el ADN mantenga su conformación normal de ADN-B sin distorsionarse para facilitar la unión de la enzima. BamHI es un dímero simétrico . El ADN se une en una gran hendidura que se forma entre los dímeros; la enzima se une de forma cruzada. Cada subunidad de BamHI establece la mayoría de sus contactos de cadena principal con los fosfatos de una mitad del sitio de unión del ADN, pero los contactos de pares de bases se establecen entre cada subunidad de BamHI y las bases nitrogenadas en el surco mayor de la mitad opuesta del sitio de unión del ADN. La proteína se une a las bases mediante enlaces de hidrógeno directos o enlaces de hidrógeno mediados por agua entre la proteína y cada grupo donador/aceptor de enlaces de hidrógeno en el surco mayor. Los contactos del surco mayor se forman mediante átomos ubicados en el extremo amino de un haz de cuatro hélices paralelas. Este haz marca la interfaz del dímero BamHI, y se cree que los momentos dipolares de los átomos terminales NH2 _en este haz pueden contribuir a la estabilización electrostática .

La enzima BamHI es capaz de establecer numerosos contactos con el ADN. Los enlaces de hidrógeno mediados por agua, así como las interacciones entre la cadena principal y las cadenas laterales, facilitan la unión a la secuencia de reconocimiento de BamHI. En el surco mayor, la mayoría de los contactos enzima/ADN se producen en el extremo amino del haz de cuatro hélices paralelas, formado por las subunidades a4 y a6 de cada subunidad. Si bien la subunidad a6 no entra en el surco mayor del ADN, sus bucles precedentes interactúan con los extremos externos del sitio de reconocimiento. Por el contrario, la subunidad a4 sí entra en el surco mayor en el centro de la secuencia de reconocimiento. Se forman un total de 18 enlaces entre la enzima y el ADN a lo largo de la secuencia de reconocimiento de 6 pares de bases (12 enlaces directos y 6 enlaces mediados por agua). Arg155 y Asp154 ubicados en un anillo espiral antes de a6 están conectados con pares de bases G:C externos mientras que los pares G:C centrales están conectados con Asp154, Arg122 y Asn116 (unión directa). El enlace de hidrógeno entre el agua y Asn116 da como resultado la unión en pares de bases A:T internos (unión mediada por agua). ^{[ 1 ]} Como se mencionó anteriormente, las subunidades L y R se unen de manera cruzada, por lo que la subunidad R de BamHI contacta con la mitad izquierda del sitio de ADN de la secuencia de reconocimiento. La unión de cada subunidad de BamHI es exactamente la misma que la de su pareja simétrica. El sitio de reconocimiento para BamHI tiene una secuencia palindrómica que se puede cortar por la mitad para facilitar la visualización de los enlaces.

G G ATC C CCTA G G

A finales de 2010, había 5 estructuras cristalinas de BamHI en el Protein Data Bank.

BamHI, al igual que otras endonucleasas de restricción de tipo II, a menudo requiere metales divalentes como cofactores para catalizar la escisión del ADN. ^{[ 2 ]} El mecanismo de dos iones metálicos es uno de los posibles mecanismos catalíticos de BamHI, ya que la estructura cristalina de BamHI tiene la capacidad de unirse a dos iones metálicos en el sitio activo, lo cual es adecuado para que proceda el mecanismo clásico de dos iones metálicos. El mecanismo de dos iones metálicos es el uso de dos iones metálicos para catalizar la reacción de escisión de la enzima de restricción. BamHI tiene tres residuos críticos en el sitio activo que son importantes para el catalizador metálico. Se conocen como Asp94, Glu111 y Glu113. Estos residuos son generalmente ácidos. En presencia de un ion metálico, los residuos apuntan hacia el ion metálico. En ausencia de iones metálicos, los residuos apuntan hacia afuera. Los dos iones metálicos (A y B) están separados 4,1 entre sí en el sitio activo y están alineados con estos residuos. ^{[ 3 ]} En general, cuando los dos iones metálicos (A y B) se unen al sitio activo, ayudan a estabilizar una distribución de cargas negativas localizadas en dicho sitio, creada por la salida de un átomo de oxígeno durante el estado de transición. Primero, una molécula de agua se activará por el ion metálico A en el sitio activo. Esta molécula de agua actuará como molécula atacante, atacando el complejo BamHI-ADN y, por lo tanto, volviéndolo negativo. Posteriormente, otra molécula de agua se unirá al ion metálico B y donará un protón al grupo saliente del complejo, estabilizando la acumulación de carga negativa en el átomo de oxígeno saliente. ^{[ 4 ]}

Se conoce la función del Ca2+ en el sitio activo de BamHI. Es un inhibidor de la escisión del ADN, convirtiendo a BamHI en un estado prereactivo. Esto reveló que la molécula de agua es la molécula atacante. Dona un protón al grupo saliente que está unido al Ca2+ formando un ángulo de enlace OPO de 90°. Si el Glu 113 se reemplaza por lisina, la escisión se pierde ya que el Glu 113 acepta el protón de la molécula de agua atacante. ^{[ 3 ]}

Debido a su capacidad para reconocer secuencias de ADN específicas y cortarlas mediante una nucleasa, BamHI tiene diversas implicaciones para la comprensión de las endonucleasas de restricción de tipo II, la clonación de ADN y, posiblemente, el tratamiento de ciertas enfermedades derivadas de mutaciones del ADN mediante terapia génica. ^{[ 1 ]} Los síndromes NARP y MILS, por ejemplo, son enfermedades mitocondriales que pueden ser causadas por mutaciones en el ADN mitocondrial. Las mitocondrias pueden recuperar sus funciones tras la escisión de la secuencia mutante mediante una endonucleasa de restricción. ^{[ 5 ]}

• Desoxirribonucleasa+BamHI en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.