Complementación de fluorescencia bimolecular

Existen diferentes sistemas de producción que pueden utilizarse para generar la proteína de fusión. La expresión génica transitoria se emplea para identificar interacciones proteína-proteína in vivo , así como la localización subcelular del complejo BiFC. Sin embargo, es necesario tener precaución con la sobreexpresión de proteínas, ya que esto puede alterar tanto la localización preferencial como los complejos proteicos predominantes formados. En su lugar, se deben utilizar promotores débiles , bajos niveles de ADN plasmídico en la transfección y vectores plasmídicos que no se replican en células de mamíferos para expresar proteínas a niveles cercanos a sus niveles endógenos y así imitar el entorno celular fisiológico. ^{[ 11 ]} Asimismo, es importante una cuidadosa selección de la proteína fluorescente, ya que diferentes proteínas fluorescentes requieren diferentes entornos celulares. Por ejemplo, la GFP se puede utilizar en células de E. coli , mientras que la YFP se utiliza en células de mamíferos. ^{[ 12 ]}

Las líneas celulares estables con el vector de expresión integrado en su genoma permiten una expresión génica más estable en la población celular, lo que resulta en resultados más consistentes. ^{[ 1 ]}

Al decidir el sitio de fusión del enlazador en la superficie de la proteína, hay tres consideraciones principales. Primero, los fragmentos de proteína fluorescente deben poder asociarse entre sí cuando sus proteínas unidas interactúan. ^{[ 11 ]} La información estructural y la ubicación de la superficie de interacción pueden ser útiles para determinar el sitio de fusión al enlazador, aunque esta información no es necesaria, ya que se pueden analizar múltiples combinaciones y permutaciones. ^{[ 11 ]} En segundo lugar, la creación de la proteína de fusión no debe alterar significativamente la localización, la estabilidad o la expresión de las proteínas a las que se unen los fragmentos en comparación con las proteínas endógenas de tipo silvestre . ^{[ 11 ]} Finalmente, la adición de la fusión del fragmento fluorescente no debe afectar la función biológica de la proteína, preferiblemente verificada mediante ensayos que evalúen todas las funciones conocidas de las proteínas. ^{[ 11 ]}

Un enlazador es una secuencia corta de aminoácidos que une el fragmento de proteína reportera fluorescente a la proteína de interés, formando la proteína de fusión. Al diseñar una secuencia de enlazador, se debe asegurar que sea suficientemente soluble y larga para proporcionar a los fragmentos de proteína fluorescente flexibilidad y libertad de movimiento, de modo que el fragmento y su fragmento asociado colisionen con la frecuencia suficiente para reconstituirse durante la interacción de sus respectivas proteínas fusionadas. ^{[ 1 ]} Aunque no está documentado, es posible que la longitud o la secuencia del enlazador influyan en la complementación de algunas proteínas. ^{[ 11 ]} Las secuencias de enlazador reportadas RSIAT y RPACKIPNDLKQKVMNH (código de un solo aminoácido) y AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) se han utilizado con éxito en experimentos de BiFC. ^{[ 8 ] [ 13 ]}

Al diseñar vectores plasmídicos para expresar las proteínas de interés, el constructo debe ser capaz de expresar proteínas que puedan formar proteínas de fusión con fragmentos de proteínas fluorescentes sin alterar la función de la proteína. Además, el complejo proteico esperado debe ser capaz de aceptar la estabilización de la interacción del fragmento de proteína fluorescente sin afectar la función del complejo proteico ni la célula en estudio. Muchos fragmentos de proteínas fluorescentes que se combinan de varias maneras pueden usarse en BiFC. ^{[ 8 ] [ 13 ]} Generalmente, se recomienda que YFP sirva como proteína reportera, escindida en el residuo 155 (N-terminal compuesto por residuos 1–154 y C-terminal compuesto por residuos 155–238) o en el residuo 173 en particular, ya que estos conjuntos de fragmentos son altamente eficientes en su complementación cuando se fusionan a muchas proteínas interactuantes y producen bajos niveles de fluorescencia cuando se fusionan a proteínas no interactuantes. Se sugiere que cada proteína diana se fusione a los fragmentos N- y C-terminales de la proteína reportera fluorescente, y que los fragmentos se fusionen en cada uno de los extremos N- y C-terminales de las proteínas diana. Esto permitirá un total de ocho permutaciones diferentes, con interacciones que se probarán: ^{[ 1 ]}

Fragmento N-terminal fusionado a la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado a la proteína N-terminal 2 Fragmento N-terminal fusionado a la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado a la proteína C-terminal 2 Fragmento N-terminal fusionado a la proteína C-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado a la proteína N-terminal 2 Fragmento N-terminal fusionado a la proteína C-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado a la proteína C-terminal 2 Fragmento C-terminal fusionado a la proteína N-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado a la proteína C-terminal 2 Fragmento C-terminal fusionado a la proteína C-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado a la proteína N-terminal 2 Fragmento C-terminal fusionado a la proteína C-terminal 1 + Fragmento N-terminal fusionado a la proteína C-terminal 2

Como se indicó anteriormente, es importante asegurarse de que la proteína reportera fluorescente que se utiliza en BiFC sea apropiada y pueda expresarse en el sistema de cultivo celular elegido, ya que no todas las proteínas reporteras pueden fluorescer o visualizarse en todos los sistemas modelo .

Los fragmentos de proteínas fluorescentes pueden asociarse y fluorescer con baja eficiencia en ausencia de una interacción específica. Por lo tanto, es importante incluir controles para asegurar que la fluorescencia de la reconstitución de la proteína reportera fluorescente no se deba a un contacto inespecífico. ^{[ 14 ]}

Algunos controles incluyen fragmentos de fluoróforo unidos a proteínas que no interactúan, ya que la presencia de estas fusiones tiende a disminuir la complementación no específica y los resultados falsos positivos . ^{[ 7 ]}

Otro control se crea uniendo el fragmento de proteína fluorescente a proteínas con caras de interacción mutadas. ^{[ 8 ] [ 13 ]} Siempre que el fragmento fluorescente se fusione a las proteínas mutadas de la misma manera que la proteína de tipo silvestre, y los niveles de expresión génica y la localización no se vean afectados por la mutación , esto sirve como un fuerte control negativo, ya que las proteínas mutantes, y por lo tanto, los fragmentos fluorescentes, deberían ser incapaces de interactuar.

También son necesarios controles internos para normalizar las diferencias en la eficiencia de la transfección y la expresión génica en distintas células. Esto se logra mediante la cotransfección de células con plásmidos que codifican las proteínas de fusión de interés, así como una proteína completa (no fragmentada) que fluoresce a una longitud de onda diferente a la de la proteína reportera fluorescente. Durante la visualización, se determinan las intensidades de fluorescencia del complejo BiFC y del control interno que, tras restar la señal de fondo, se convierte en una relación. Esta relación representa la eficiencia del BiFC y puede compararse con otras relaciones para determinar la eficiencia relativa de la formación de diferentes complejos. ^{[ 11 ]}

Una vez diseñadas y generadas las proteínas de fusión y los controles en su sistema de expresión apropiado, los plásmidos deben transfectarse en las células que se van a estudiar. Tras la transfección, es necesario esperar, normalmente unas ocho horas, para que las proteínas de fusión interactúen y sus fragmentos de proteína reportera fluorescente unidos se asocien y emitan fluorescencia. ^{[ 8 ]}

Tras un tiempo suficiente para que las proteínas de fusión y sus fragmentos fluorescentes unidos interactúen y emitan fluorescencia, las células pueden observarse bajo un microscopio de fluorescencia invertido que permite visualizar la fluorescencia celular. Si bien la intensidad de fluorescencia de los complejos BiFC suele ser inferior al 10 % de la producida por la expresión de proteínas fluorescentes intactas, la autofluorescencia extremadamente baja en el rango visible de la mayoría de las células suele hacer que la señal BiFC sea varios órdenes de magnitud superior a la fluorescencia de fondo. ^{[ 15 ]}

Si se detecta fluorescencia al expresar las proteínas de fusión, pero esta desaparece o se reduce significativamente tras la expresión del control negativo mutado, es probable que exista una interacción específica entre las dos proteínas diana de interés. Sin embargo, si la intensidad de la fluorescencia no difiere significativamente entre la proteína de fusión de control negativo mutada y su homóloga de tipo silvestre, es probable que la fluorescencia se deba a interacciones proteicas inespecíficas, por lo que se debería probar una combinación diferente de conformaciones de la proteína de fusión.

Si no se detecta fluorescencia, aún podría existir una interacción entre las proteínas de interés, ya que la creación de la proteína de fusión podría alterar la estructura o la superficie de interacción de la proteína diana, o bien los fragmentos fluorescentes podrían ser físicamente incapaces de asociarse. Para asegurar que este resultado no sea un falso negativo , es decir, que no exista interacción, la interacción proteica debe evaluarse en una situación donde la complementación y activación de la fluorescencia requieran una señal externa. En este caso, si la señal externa no provoca la asociación de los fragmentos fluorescentes, es probable que las proteínas no interactúen o que exista un impedimento físico para la complementación de la fluorescencia. ^{[ 11 ]}

Las proteínas interactúan con otras proteínas y macromoléculas para desempeñar funciones que sustentan diversas funciones celulares esenciales para la supervivencia del organismo. La identificación de estas interacciones puede aportar pistas sobre sus efectos en los procesos celulares. Dado que estas interacciones pueden verse afectadas tanto por el entorno interno como por estímulos externos, su estudio in vivo y a nivel endógeno, como se recomienda en BiFC, proporciona un contexto fisiológicamente relevante a partir del cual extraer conclusiones sobre las interacciones proteicas.

La técnica BiFC permite la visualización directa de las interacciones proteicas en células vivas con una mínima alteración celular , en lugar de depender de efectos secundarios o tinción con moléculas exógenas que pueden no distribuirse uniformemente. ^{[ 1 ]} Esto, junto con la capacidad de observar las células vivas durante largos periodos de tiempo, es posible gracias a la fuerte fluorescencia intrínseca de la proteína reportera reconstituida, que reduce las probabilidades de una lectura incorrecta asociada al proceso de aislamiento de proteínas. ^{[ 1 ] [ 16 ]}

A diferencia de muchos ensayos de interacción de proteínas in vivo , BiFC no requiere que los complejos proteicos se formen con una gran proporción de las proteínas ni en proporciones estequiométricas . En cambio, BiFC puede detectar interacciones entre subpoblaciones de proteínas , interacciones débiles y proteínas de baja expresión debido a la complementación estable de la proteína reportera fluorescente. ^{[ 12 ] [ 17 ]} Además, se ha informado de la reconstitución exitosa de proteínas fluorescentes para socios proteicos  separados por más de 7 nm, siempre que los enlazadores que unen el fragmento fluoróforo a la proteína de interés tengan la flexibilidad necesaria para asociarse con su fragmento correspondiente. ^{[ 14 ]} Además, la fuerza de la interacción proteica se puede determinar cuantitativamente mediante cambios en la intensidad de la señal fluorescente. ^{[ 2 ]}

BiFC permite medir cambios espaciales y temporales en complejos proteicos, incluso en respuesta a fármacos activadores e inhibidores y a nivel subcelular, proporcionando la mayor resolución espacial de los ensayos de interacción proteína-proteína in vivo . ^{[ 8 ] [ 18 ] [ 19 ]}

BiFC no requiere equipo especializado, ya que la visualización es posible con un microscopio de fluorescencia invertido que puede detectar fluorescencia en las células. ^{[ 14 ]} Además, el análisis no requiere un procesamiento de datos complejo ni corrección para otras fuentes de fluorescencia. ^{[ 8 ]}

La técnica BiFC puede realizarse sin información estructural sobre los socios de interacción, siempre que los fragmentos de la proteína reportera fluorescente puedan asociarse dentro del complejo, ya que se pueden analizar múltiples combinaciones de proteínas de fusión. Esto se debe a la suposición de que, dado que las funciones de la proteína se reproducen en el contexto in vivo , la estructura del complejo se asemejará a la de las proteínas intactas observadas fisiológicamente. ^{[ 15 ]}

La tecnología BiFC se ha perfeccionado y ampliado para incluir la capacidad de visualizar simultáneamente múltiples complejos proteicos en la misma célula , interacciones ARN/proteína , detectar rápidamente cambios en las vías de transducción genética, demostrar fenotipos ocultos de fármacos , donde el resultado del tratamiento previsto (es decir, muerte celular, diferenciación, cambio morfológico) no se observa in vivo , estudiar la formación de complejos en diferentes compartimentos celulares y mapear superficies de interacción proteica ^{[ 13 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

La señal fluorescente solo se produce después de que las proteínas hayan interactuado, lo que generalmente ocurre en el orden de horas. Por lo tanto, BiFC no puede proporcionar detección en tiempo real de las interacciones proteicas. El retraso en las reacciones químicas para generar el fluoróforo también puede afectar la dinámica de la disociación del complejo y el intercambio de parejas. ^{[ 1 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 23 ]}

La formación del complejo BiFC solo es reversible durante la etapa inicial del reensamblaje de la proteína reportera fluorescente, típicamente en el orden de milisegundos. Una vez que el fluorocromo se ha reconstituido, es esencialmente irreversible in vitro . Esto impide que las proteínas interactúen entre sí y puede alterar la asociación/disociación de complejos proteicos en equilibrio dinámico . ^{[ 1 ]}

Los fragmentos de proteínas fluorescentes tienen una capacidad limitada para asociarse independientemente de las proteínas a las que se fusionan. Si bien la asociación independiente de proteínas variará según la identidad de las proteínas de fusión y sus niveles de expresión, es necesario proporcionar los controles necesarios y numerosos para distinguir entre interacciones proteicas verdaderas y falsas positivas. Generalmente, esta limitación se mitiga asegurando que las proteínas de fusión de interés se expresen en concentraciones endógenas. ^{[ 1 ]}

La unión de fragmentos fluorescentes puede alterar el plegamiento o la estructura de la proteína de interés, lo que conlleva la eliminación del sitio de unión superficial de la proteína interactuante . Además, la disposición de los fragmentos fluorescentes puede impedir la reconstitución del fluoróforo por impedimento estérico , si bien este impedimento puede reducirse o eliminarse mediante el uso de una secuencia de enlace que permita la flexibilidad suficiente para la asociación de los fragmentos fluorescentes. Por lo tanto, la ausencia de complementación de fluorescencia puede ser un falso negativo y no necesariamente demuestra que la interacción en cuestión no se produzca.

Debido a que la formación del fluoróforo requiere oxígeno molecular, el BiFC no puede utilizarse en anaerobios obligados , que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. Esto limita el uso del BiFC a organismos aerobios . ^{[ 1 ]}

La autofluorescencia generalmente no es un problema, ya que la señal BiFC será mucho mayor que el fondo. ^{[ 24 ] [ 25 ]} Sin embargo, ciertos organismos, especialmente los apicomplejos , tienen una autofluorescencia más alta que dificulta la aplicación de BiFC en ellos. ^{[ 26 ]} Ciertos hongos, como Candida albicans , también tienen un fondo autofluorescente alto, pero a menudo se puede realizar BiFC cuando se utilizan los controles y cepas adecuados. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Dado que las proteínas endógenas de tipo silvestre no pueden visualizarse in vivo , es necesario crear proteínas de fusión y transfectar sus plásmidos en las células estudiadas. Estas proteínas de fusión pueden no reproducir las funciones, la localización y las interacciones comunes a sus homólogas de tipo silvestre, lo que proporciona una imagen inexacta de las proteínas en cuestión. Este problema puede mitigarse utilizando información estructural y la ubicación de los sitios de interacción para identificar racionalmente los sitios de fusión en las proteínas de interés, empleando controles apropiados y comparando los niveles de expresión y las funciones de las proteínas de fusión y de tipo silvestre mediante Western Blots y ensayos funcionales. ^{[ 1 ]}

Aunque las bajas temperaturas favorecen la reconstitución de la fluorescencia cuando los fragmentos están próximos, esto puede afectar el comportamiento de las proteínas objetivo, lo que lleva a conclusiones inexactas sobre la naturaleza de las interacciones proteicas y sus socios de interacción. ^{[ 17 ]}

Debido a que la reconstitución del fluoróforo puede ocurrir a una distancia de 7  nm o más, la complementación de fluorescencia puede indicar una interacción directa o indirecta (es decir, dentro del mismo complejo) entre las proteínas fusionadas de los fragmentos fluorescentes. ^{[ 16 ]}

El sistema BiFC se ha aplicado para registrar eventos de biogénesis de ribosomas en E. coli . ^{[ 29 ]} El proceso de ensamblaje de ribosomas implica la nucleación de proteínas ribosómicas en el orden y la orientación adecuados. Las perturbaciones en el ensamblaje pueden provocar defectos estructurales en las subunidades ribosómicas, que, como resultado, no pueden unirse en la orientación correcta para formar ribosomas completamente funcionales. Por lo tanto, los eventos de unión de subunidades, señalados por la aparición de BiFC, constituyen una forma sencilla de monitorizar la biogénesis de ribosomas, en contraste con los laboriosos métodos de perfilado de polisomas .

Los fragmentos de proteína fluorescente utilizados en BiFC se han ampliado para incluir los colores azul, cian, verde, amarillo, rojo, cereza y Venus . ^{[ 8 ] [ 13 ] [ 30 ] [ 31 ]} Esta gama de colores ha hecho posible el desarrollo del análisis de complementación de fluorescencia multicolor. ^{[ 13 ]} Esta técnica permite visualizar simultáneamente múltiples complejos proteicos en la misma célula. Además, las proteínas suelen tener un gran número de socios de interacción alternativos. Por lo tanto, al fusionar fragmentos de diferentes proteínas fluorescentes a proteínas candidatas, se puede estudiar la competencia entre socios de interacción alternativos para la formación de complejos mediante la complementación de diferentes fragmentos de color fluorescente. ^{[ 13 ]}

La técnica BiFC se ha ampliado para incluir el estudio de las interacciones de proteínas de unión a ARN en un método que Rackham y Brown describieron como complementación de fluorescencia trimolecular (TriFC). ^{[ 20 ]} En este método, un fragmento de la proteína fluorescente Venus se fusiona al ARNm de interés, y la porción complementaria de Venus se fusiona a la proteína de unión a ARN de interés. De forma similar a BiFC, si el ARNm y la proteína interactúan, la proteína Venus se reconstituirá y fluorescerá. También conocido como método del puente de ARN, dado que el fluoróforo y otras proteínas interactuantes forman un puente entre la proteína y el ARN de interés, esto permite una detección y localización sencillas de las interacciones ARN-proteína dentro de una célula viva y proporciona un método simple para detectar la asociación ARN-proteína directa o indirecta (es decir, dentro de un complejo) que puede verificarse mediante análisis in vitro de compuestos purificados o la inactivación por ARNi de la(s) molécula(s) puente. ^{[ 20 ]}

BiFC puede utilizarse para vincular genes entre sí y su función mediante la medición de las interacciones entre las proteínas que codifican dichos genes. ^{[ 21 ] [ 22 ]} Esta aplicación es ideal para genes nuevos sobre los que se conoce poco acerca de sus efectores ascendentes y descendentes , ya que permite establecer nuevas conexiones de vías. Además, los efectos de fármacos, hormonas , o la deleción o silenciamiento del gen de interés, así como los efectos subsiguientes tanto en la fuerza de las interacciones proteína-proteína como en la localización de la interacción, pueden observarse en cuestión de segundos. ^{[ 18 ] [ 19 ]}

BiFC se ha utilizado para estudiar la translocación nuclear , a través de la localización compleja, así como las interacciones que involucran proteínas de membrana integrales . ^{[ 8 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]} Por lo tanto, BiFC es una herramienta importante para comprender la localización de factores de transcripción en compartimentos subcelulares.

La técnica BiFC se ha acoplado a la citometría de flujo (BiFC-FC). Esto permite mapear las superficies de interacción proteína-proteína mediante la introducción de mutaciones dirigidas o aleatorias que afectan la formación de complejos. ^{[ 2 ]}

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ), también conocida como transferencia de energía por resonancia de Förster , transferencia de energía por resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ), se basa en la transferencia de energía desde un cromóforo o fluoróforo excitado ( donante ) (si los cromóforos son fluorescentes) a un aceptor cercano . En este método, los fluoróforos se unen químicamente o se fusionan genéticamente a dos proteínas que se hipotetiza que interactúan. Si las proteínas interactúan, esto acercará los fluoróforos espacialmente. Si los fluoróforos se orientan de manera que se expongan entre sí, lo cual generalmente se garantiza al diseñar y construir la unión/fusión fluoróforo-proteína, entonces la transferencia de energía desde el fluoróforo donante excitado dará como resultado un cambio en las intensidades o tiempos de vida de fluorescencia de los fluoróforos. ^{[ 1 ] [ 14 ]}

El sistema de doble híbrido de levadura ( Y2H ) es una técnica de cribado genético que permite detectar interacciones físicas (de unión) entre proteínas o entre proteínas y ADN . Generalmente se aplica en el organismo modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae . Consiste en probar una proteína "cebo" de función (des)conocida, fusionada, por ejemplo, al dominio de unión del factor de transcripción GAL4, frente a posibles proteínas interactuantes o una biblioteca de ADNc que expresa, por ejemplo, el dominio de activación de GAL4 (la "presa"). ^{[ 43 ] [ 44 ]}