Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Biotinilación

En bioquímica , la biotinilación es el proceso de unir covalentemente biotina a una proteína, ácido nucleico u otra molécula. La biotinilación es rápida, específica y es poco pr...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

En bioquímica , la biotinilación es el proceso de unir covalentemente biotina a una proteína, ácido nucleico u otra molécula. La biotinilación es rápida, específica y es poco probable que altere la función natural de la molécula debido al pequeño tamaño de la biotina (MW = 244,31 g/mol). La biotina se une a la estreptavidina y la avidina con una afinidad extremadamente alta, una rápida velocidad de unión y una alta especificidad, y estas interacciones se aprovechan en muchas áreas de la biotecnología para aislar moléculas biotiniladas de interés. La unión de la biotina a la estreptavidina y la avidina es resistente a temperaturas extremas, pH y proteólisis, lo que permite la captura de moléculas biotiniladas en una amplia variedad de entornos. Además, se pueden conjugar múltiples moléculas de biotina a una proteína de interés, lo que permite la unión de múltiples moléculas de proteína de estreptavidina , avidina o neutravidina y aumenta la sensibilidad de detección de la proteína de interés. Existe una gran cantidad de reactivos de biotinilación disponibles que aprovechan la amplia gama de métodos de marcaje posibles. Debido a la fuerte afinidad entre la biotina y la estreptavidina, la purificación de proteínas biotiniladas ha sido un enfoque ampliamente utilizado para identificar interacciones proteína-proteína y eventos postraduccionales como la ubiquitinación [ 1 ] en biología molecular.

Métodos de etiquetado

Las proteínas pueden biotinilarse química o enzimáticamente. La biotinilación química utiliza diversas químicas de conjugación para producir biotinilación no específica de aminas, carboxilatos, sulfhidrilos y carbohidratos (por ejemplo, el acoplamiento NHS produce biotinilación de cualquier amina primaria en la proteína). La biotinilación enzimática produce biotinilación de una lisina específica dentro de una secuencia determinada por una biotina ligasa bacteriana. [ 2 ] La mayoría de los reactivos de biotinilación química consisten en un grupo reactivo unido a través de un enlazador a la cadena lateral de ácido valérico de la biotina. Como el bolsillo de unión de la biotina en la avidina/estreptavidina está enterrado debajo de la superficie de la proteína, los reactivos de biotinilación que poseen un enlazador más largo son deseables, ya que permiten que la molécula de biotina, una vez que se ha unido a su objetivo, sea más accesible para la unión a la proteína avidina/estreptavidina/neutravidina. Este enlazador también puede mediar la solubilidad de los reactivos de biotinilación; Los enlazadores que incorporan poli(etilenglicol) (PEG) pueden hacer solubles los reactivos insolubles en agua o aumentar la solubilidad de los reactivos de biotinilación que ya son solubles en cierta medida.

Biotinilación enzimática

A diferencia de los métodos de biotinilación química, la biotinilación enzimática permite que la biotina se una a un único residuo presente en la proteína. Esta reacción de biotinilación puede completarse, lo que significa que el producto se genera con alta uniformidad y puede unirse a la estreptavidina en una orientación definida, por ejemplo, para multímeros de MHC . La biotinilación enzimática se lleva a cabo con mayor frecuencia mediante la biotina holoenzima sintetasa de E. coli , también conocida como biotina ligasa (BirA, P06709 ). [ 3 ] [ 4 ]

La forma más común de dirigir una proteína de interés es fusionando la proteína en su extremo N , extremo C o en un bucle interno a un péptido de 15 aminoácidos (GLNDIFEAQKIEWHE), denominado AviTag o Péptido Aceptor (PA). [ 5 ] Una vez marcada, la proteína se incuba con BirA, lo que permite que tenga lugar la biotinilación en presencia de biotina y ATP. [ 5 ] La biotinilación enzimática puede llevarse a cabo in vitro , pero BirA también reacciona específicamente con su péptido diana dentro de las células de mamíferos y bacterias y en la superficie celular, mientras que otras proteínas celulares no se modifican. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] La biotinilación enzimática también puede tener lugar in vivo, generalmente a través de la coexpresión de una proteína marcada con Avitag y BirA. [ 9 ]

El sustrato natural de BirA es la proteína transportadora de carboxilo de biotina (BCCP). Antes del descubrimiento de etiquetas más pequeñas, era necesario fusionar una proteína a la BCCP completa para poder dirigirla. [ 10 ] Una proteína fusionada con BCCP puede ser reconocida por moléculas de biotina in vivo y unirse a ella. [ 11 ] Se han utilizado otras etiquetas pequeñas antes de AviTag, pero AviTag es la más eficiente hasta el momento. [ 4 ]

Biotinilación de aminas primarias

Los objetivos más comunes para modificar las moléculas de proteínas son los grupos amina primarios que están presentes como aminas épsilon de la cadena lateral de lisina y aminas α N-terminales. Los reactivos de biotinilación reactivos con aminas se pueden dividir en dos grupos según su solubilidad en agua .

Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) tienen baja solubilidad en soluciones acuosas . Para reacciones en solución acuosa, primero deben disolverse en un disolvente orgánico y luego diluirse en la mezcla de reacción acuosa . Los disolventes orgánicos más comúnmente utilizados para este propósito son el dimetilsulfóxido (DMSO) y la dimetilformamida (DMF), que son compatibles con la mayoría de las proteínas a bajas concentraciones. [ 12 ] Debido a la hidrofobicidad de los ésteres de NHS, los reactivos de biotinilación de NHS también pueden difundirse a través de la membrana celular , lo que significa que biotinilarán tanto los componentes internos como externos de una célula .

Los ésteres de sulfo-NHS son más solubles en agua y deben disolverse en ella justo antes de su uso, ya que se hidrolizan fácilmente. La solubilidad en agua de los ésteres de sulfo-NHS se debe al grupo sulfonato presente en el anillo de N-hidroxisuccinimida , lo que elimina la necesidad de disolver el reactivo en un disolvente orgánico. Los ésteres de sulfo-NHS de biotina también pueden utilizarse como reactivos para la biotinilación de la superficie celular, puesto que no penetran la membrana celular .

Las reacciones químicas de los ésteres de NHS y sulfo-NHS son prácticamente idénticas, ya que ambos reaccionan espontáneamente con aminas para formar un enlace amida. Dado que el objetivo del éster es una amina primaria desprotonada, la reacción se ve favorecida en condiciones básicas (por encima de pH 7). La hidrólisis del éster de NHS es una reacción competitiva importante, y la velocidad de hidrólisis aumenta con el incremento del pH . Los ésteres de NHS y sulfo-NHS tienen una vida media de varias horas a pH 7, pero de tan solo unos minutos a pH 9.

Existe cierta flexibilidad en las condiciones para la conjugación de ésteres de NHS con aminas primarias. Las temperaturas de incubación pueden oscilar entre 4 y 37  °C, el pH entre 7 y 9, y el tiempo de incubación entre unos minutos y 12 horas. Deben evitarse los tampones que contienen aminas (como Tris o glicina ), ya que compiten con la reacción.

Biotinilación de sulfhidrilo

Una alternativa a la biotinilación de aminas primarias es marcar los grupos sulfhidrilo con biotina. Dado que los grupos sulfhidrilo libres son menos frecuentes en la mayoría de las proteínas en comparación con las aminas primarias, la biotinilación de sulfhidrilo es útil cuando las aminas primarias se encuentran en el/los dominio(s) regulador(es) de la proteína diana o cuando se requiere un nivel reducido de biotinilación. Los grupos reactivos con sulfhidrilo, como las maleimidas , los haloacetilos y los disulfuros de piridilo, requieren grupos sulfhidrilo libres para la conjugación; los enlaces disulfuro deben reducirse primero para liberar los grupos sulfhidrilo para la biotinilación. Si no hay grupos sulfhidrilo libres disponibles, las lisinas pueden modificarse con varios reactivos de tiolación ( reactivo de Traut , SAT(PEG4), SATA y SATP), lo que resulta en la adición de un sulfhidrilo libre. La biotinilación de grupos sulfhidrilo se realiza a un pH ligeramente inferior (6,5-7,5) que el marcaje con ésteres de NHS.

Además de las proteínas completas, los péptidos biotinilados pueden sintetizarse introduciendo un residuo de cisteína (Cys) durante la síntesis en el extremo de la cadena de aminoácidos para obtener una biotinilación específica y orientada. Los nucleótidos también pueden biotinilarse mediante la incorporación de nucleótidos tiolados .

Biotinilación de carboxilo

Los grupos carboxilo se encuentran en los extremos C-terminales de las proteínas y en las cadenas laterales de los aminoácidos glutamato y aspartato. Los reactivos de biotinilación que actúan sobre los grupos carboxilo no poseen una porción reactiva al carboxilo propiamente dicha, sino que utilizan un agente reticulante de carbodiimida, como el EDC, para unir la amina primaria de los reactivos de biotinilación al grupo carboxilo de la proteína diana.

La biotinilación en los grupos carboxilo se produce a un pH de 4,5 a 5,5. Para evitar la reactividad cruzada del agente reticulante con los componentes del tampón, este no debe contener aminas primarias (por ejemplo, Tris , glicina ) ni grupos carboxilo (por ejemplo, acetato , citrato ); el tampón MES es una opción ideal.

Biotinilación de glicoproteínas

Las glicoproteínas pueden biotinilarse modificando los residuos de carbohidratos a aldehídos , que luego reaccionan con reactivos de biotinilación basados ​​en hidrazina o alcoxiamina . El periodato de sodio oxida los ácidos siálicos de las glicoproteínas a aldehídos para formar estos enlaces estables a un pH de 4 a 6.

Los anticuerpos policlonales están altamente glicosilados, y dado que la glicosilación no interfiere con la actividad del anticuerpo, la biotinilación de los grupos glicosilo es una estrategia ideal para generar anticuerpos biotinilados.

Biotinilación de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se biotinilan fácilmente durante la síntesis de oligonucleótidos mediante el método de fosforamidita, utilizando fosforamidita de biotina comercial. [ 13 ] Tras la desprotección estándar, los conjugados obtenidos pueden purificarse mediante HPLC de fase inversa o de intercambio aniónico.

Biotinilación no específica

Los reactivos de biotinilación fotoactivables son ideales cuando no se dispone de aminas primarias, grupos sulfhidrilo, carboxilos ni carbohidratos para el marcaje. Estos reactivos se basan en azidas de arilo, que se activan mediante luz ultravioleta (UV; >350  nm) y reaccionan en los enlaces CH y NH. Dado que estos enlaces se forman independientemente del tipo de aminoácido, este tipo de biotinilación se denomina "inespecífica".

Los reactivos de biotinilación fotoactivables también pueden utilizarse para activar la biotinilación en momentos específicos de un experimento o durante determinadas condiciones de reacción, simplemente exponiendo la reacción a la luz ultravioleta en el momento o bajo la condición específica.

Objetivo

Purificación

La etiqueta de biotina se puede utilizar en cromatografía de afinidad junto con una columna que tiene avidina (o estreptavidina o neutravidina ) unida a ella, que es el ligando natural de la biotina. Sin embargo, se necesitan condiciones drásticas (p. ej., 6 M de GuHCl a pH 1,5) para romper la interacción avidina/estreptavidina-biotina, lo que probablemente desnaturalizará la proteína que lleva la etiqueta de biotina. Si se necesita aislar la proteína marcada, es mejor marcarla con iminobiotina . Este análogo de biotina se une fuertemente a la avidina/estreptavidina a pH alcalino, pero la afinidad se reduce al disminuir el pH. Por lo tanto, una proteína funcional marcada con iminobiotina se puede liberar de una columna de avidina/estreptavidina disminuyendo el pH (a alrededor de pH 4). [ 14 ] [ 15 ]

Detección

Esta etiqueta también puede utilizarse en la detección de la proteína mediante anticuerpos anti-biotina o estrategias de detección con etiquetas de avidina/estreptavidina, como reporteros enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante , fosfatasa alcalina ) o sondas fluorescentes . Esto puede ser útil para la localización mediante microscopía de fluorescencia o electrónica, [ 16 ] ensayos ELISA , ensayos ELISPOT , Western blots y otros métodos inmunoanalíticos. La detección con estreptavidina monovalente puede evitar la agrupación o agregación del objetivo biotinilado. [ 17 ]

Otros usos

El enlace no covalente formado entre la biotina y la avidina o estreptavidina tiene una afinidad de unión superior a la de la mayoría de los enlaces antígeno-anticuerpo, y se aproxima a la fuerza de un enlace covalente . Esta unión tan fuerte hace que el marcaje de proteínas con biotina sea una herramienta útil para aplicaciones como la cromatografía de afinidad, utilizando avidina o estreptavidina inmovilizadas para separar la proteína biotinilada de una mezcla de otras proteínas y sustancias bioquímicas. La proteína biotinilada, como la albúmina sérica bovina (BSA) biotinilada, se utiliza en ensayos de fase sólida como recubrimiento en la superficie de los pocillos de placas de ensayo de múltiples pocillos. La biotinilación de glóbulos rojos se ha utilizado para determinar el volumen sanguíneo total sin el uso de radiomarcadores como el cromo 51, lo que permite determinar el volumen en bebés con bajo peso al nacer y mujeres embarazadas que, de otro modo, no podrían exponerse a las dosis de radiactividad requeridas. Además, la biotinilación de moléculas MHC para crear multímeros MHC se ha convertido en una herramienta útil para identificar y aislar poblaciones de células T antígeno-específicas . Más recientemente, se desarrolló la biotinilación de proteínas in vivo para estudiar las interacciones proteína-proteína y la proximidad en células vivas [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ].

Determinación del grado de biotinilación

Las condiciones de reacción para la biotinilación se eligen de manera que la molécula objetivo (por ejemplo, un anticuerpo) se marque con suficientes moléculas de biotina para purificar o detectar la molécula, pero no en tanta cantidad como para que la biotina interfiera con la función de la molécula.

ensayo HABA

El ensayo HABA (ácido 2-(4-hidroxiazobenceno) benzoico) permite determinar el grado de biotinilación. El colorante HABA se une a la avidina o estreptavidina y produce una absorbancia característica. Al introducir proteínas biotiniladas u otras moléculas, la biotina desplaza al colorante, lo que provoca un cambio en la absorbancia a 500  nm. Este cambio es directamente proporcional al nivel de biotina en la muestra. La desventaja del ensayo HABA es que requiere grandes cantidades de muestra.

Desplazamiento en gel de estreptavidina

El grado de biotinilación también puede medirse mediante el ensayo de desplazamiento electroforético con estreptavidina, ya que la estreptavidina permanece unida a la biotina durante la electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida . La proporción de la proteína diana biotinilada puede medirse mediante el cambio en la intensidad de la banda de la proteína diana con o sin exceso de estreptavidina, lo cual se observa de forma rápida y cuantitativa en las proteínas biotiniladas mediante tinción con azul brillante de Coomassie . [ 21 ]

Referencias

  1. ↑ Lectez, Benoît; Migotti, Rebekka; Lee, So Young; Ramirez, Juanma; Beraza, Naiara; Mansfield, Bill; Sutherland, James D.; Martinez-Chantar, Maria L.; Dittmar, Gunnar (2014-06-06). "Perfil de ubiquitina en hígado utilizando un ratón transgénico con ubiquitina biotinilada". Journal of Proteome Research . 13 (6): 3016– 3026. doi : 10.1021/pr5001913 . ISSN 1535-3893 . PMID 24730562 .  
  2. ↑ Barat, Bhaswati; Wu, Anna M. (2007). "Biotinilación metabólica de anticuerpos recombinantes por biotina ligasa retenida en el retículo endoplasmático" . Ingeniería Biomolecular . 24 (3): 283– 91. doi : 10.1016/j.bioeng.2007.02.003 . PMC 2682619. PMID 17379573 .  
  3. ↑ Samols, D.; Thornton, CG; Murtif, VL; Kumar, GK; Haase, FC; Wood, HG (1988-05-15). "Conservación evolutiva entre enzimas de biotina" . The Journal of Biological Chemistry . 263 (14): 6461– 6464. doi : 10.1016/S0021-9258(18)68661-2 . ISSN 0021-9258 . PMID 2896195 .  
  4. 1 2 Fairhead, M; Howarth, M (2015). "Biotinilación sitio-específica de proteínas purificadas mediante BirA". Marcaje de proteínas sitio-específico . Métodos en biología molecular. Vol. 1266. págs. 171–84 . doi : 10.1007/978-1-4939-2272-7_12 . ISBN   978-1-4939-2271-0. PMC 4304673 . PMID 25560075 .  
  5. 1 2 Beckett, Dorothy; Kovaleva, Elena; Schatz, Peter J. (1999). "Un sustrato peptídico mínimo en la biotinilación catalizada por la holoenzima sintetasa de biotina" . Protein Science . 8 (4): 921– 9. doi : 10.1110/ps.8.4.921 . PMC 2144313. PMID 10211839 .  
  6. ↑ De Boer, E.; Rodriguez, P; Bonte, E; Krijgsveld, J; Katsantoni, E; Heck, A; Grosveld, F; Strouboulis, J (2003). "Biotinilación eficiente y purificación en un solo paso de factores de transcripción etiquetados en células de mamíferos y ratones transgénicos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 100 (13): 7480– 5. Bibcode : 2003PNAS..100.7480D . doi : 10.1073/pnas.1332608100 . PMC 164612. PMID 12802011 .  
  7. ↑ Viens, Antoine; Mechold, Undine; Lehrmann, Heike; Harel-Bellan, Annick; Ogryzko, Vasily (2004). "Uso de la biotinilación de proteínas in vivo para la inmunoprecipitación de cromatina". Analytical Biochemistry . 325 (1): 68– 76. doi : 10.1016/j.ab.2003.10.015 . PMID 14715286 . 
  8. ↑ Howarth, Mark; Takao, Keizo; Hayashi, Yasunori; Ting, Alice Y. (2005). "Dirigiendo puntos cuánticos a proteínas de superficie en células vivas con biotina ligasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 102 (21): 7583–8 . Bibcode : 2005PNAS..102.7583H . doi : 10.1073/pnas.0503125102 . JSTOR 3375578. PMC 1129026. PMID 15897449 .   
  9. ↑ Cull, MG; Schatz, PJ (1 de enero de 2000). "Biotinilación de proteínas in vivo e in vitro mediante pequeñas etiquetas peptídicas". Aplicaciones de genes quiméricos y proteínas híbridas. Parte A: Expresión génica y purificación de proteínas . Métodos en enzimología. Vol. 326. págs. 430–440 . doi : 10.1016/s0076-6879(00)26068-0 . ISBN   9780121822279ISSN 0076-6879 PMID 11036656​​​  
  10. ↑ Argaraña, CE; Kuntz, ID; Birken, S; Axel, R; Cantor, CR (1986). "Clonación molecular y secuencia de nucleótidos del gen de la estreptavidina" . Nucleic Acids Res . 14 (4): 1871– 82. doi : 10.1093 / nar/14.4.1871 . PMC 339579. PMID 3951999 .  
  11. ↑ "Biotilación de proteínas in vivo" .
  12. ↑Brawn, Peter (2024-07-17). "5-Step Guide to Chemical Biotinylation / Biotin Conjugation". LifeSynth Solutions. Retrieved 2024-07-24.
  13. ↑Pon, Richard T. (1991). "A long chain biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5′-biotinylated oligonucleotides". Tetrahedron Letters. 32 (14): 1715–8. doi:10.1016/S0040-4039(00)74311-5.
  14. ↑Hofmann, Klaus; Wood, Sara W.; Brinton, Charles C.; Montibeller, Judith A.; Finn, Frances M. (1980). "Iminobiotin Affinity Columns and Their Application to Retrieval of Streptavidin". Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (8): 4666–8. Bibcode:1980PNAS...77.4666H. doi:10.1073/pnas.77.8.4666. JSTOR 9166. PMC 349906. PMID 6933515.
  15. ↑Sugawara, Kazuharu; Kamiya, Naoto; Hirabayashi, George; Kuramitz, Hideki (2005). "Voltammetric Homogeneous Binding Assay of Biotin without a Separation Step Using Iminobiotin Labeled with an Electroactive Compound". Analytical Sciences. 21 (8): 897–900. doi:10.2116/analsci.21.897. PMID 16122157.
  16. ↑Viens, A.; Harper, F.; Pichard, E.; Comisso, M.; Pierron, G.; Ogryzko, V. (2008). "Use of Protein Biotinylation in Vivo for Immunoelectron Microscopic Localization of a Specific Protein Isoform". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (10): 911–9. doi:10.1369/jhc.2008.951624. PMC 2544619. PMID 18574249.
  17. ↑Howarth, Mark; Chinnapen, Daniel J-F; Gerrow, Kimberly; Dorrestein, Pieter C; Grandy, Melanie R; Kelleher, Neil L; El-Husseini, Alaa; Ting, Alice Y (2006). "A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site". Nature Methods. 3 (4): 267–73. doi:10.1038/nmeth861. PMC 2576293. PMID 16554831.
  18. ↑ Fernández-Suárez, Marta; Chen, T. Scott; Ting, Alice Y. (2008). "Detección de interacción proteína-proteína in vitro y en células mediante biotinilación por proximidad" . Journal of the American Chemical Society . 130 (29): 9251–3 . doi : 10.1021/ja801445p . PMC 2635094. PMID 18582056 .  
  19. ↑ Kulyyassov, Arman; Shoaib, Muhammad; Pichugin, Andrei; Kannouche, Patricia; Ramanculov, Erlan; Lipinski, Marc; Ogryzko, Vasily (2011). "PUB-MS: Un método basado en espectrometría de masas para monitorizar la proximidad proteína-proteína in vivo". Journal of Proteome Research . 10 (10): 4416– 27. arXiv : 1108.5657 . doi : 10.1021/pr200189p . PMID 21842862 . S2CID 16887424 .  
  20. ^ Shoaib, M.; Kulyyassov, A.; Robin, C.; Winczura, K.; Tarlykov, P.; Despás, E.; Kannouche, P.; Ramanculov, E.; Lipinski, M.; Ogrizko, V. (2012). "PUB-NChIP - Enfoque de" biotinilación in vivo "para estudiar la cromatina cerca de una proteína de interés" . Investigación del genoma . 23 (2): 331– 40. doi : 10.1101/gr.134874.111 . PMC 3561874 . PMID 23038767 .  
  21. ↑ Jain, J.; Veggiani, G.; Howarth, M. (2013). "La carga de colesterol y las interacciones de proteínas ultraestables determinan el nivel de marcador tumoral requerido para el aislamiento óptimo de células cancerosas" . Cancer Research . 73 (7): 2310–21 . doi : 10.1158/0008-5472.CAN-12-2956 . PMC 3618857. PMID 23378340 .  

Lecturas adicionales

  • Hermanson, GT. Técnicas de bioconjugación. Academic Press ISBN 0-12-342336-8
  • Descripción general de la biotinilación : incluye información adicional y figuras de grupos reactivos, biotina y regiones de enlace.
  • Gao, Wenqing; Wu, Zengru; Bohl, Casey E.; Yang, Jun; Miller, Duane D.; Dalton, James T. (2005). "Caracterización del metabolismo in vitro de un modulador selectivo del receptor de andrógenos utilizando preparaciones enzimáticas de hígado humano, de rata y de perro" . Drug Metabolism and Disposition . 34 (2): 243– 53. doi : 10.1124/dmd.105.007112 . PMC 2039882. PMID 16272404 .