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Bottromicina

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La bottromicina es un péptido macrocíclico con actividad antibiótica . Fue descubierta por primera vez en 1957 como un producto natural aislado de Streptomyces bottropensis . [ 1 ] Se ha demostrado que inhibe Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ( MRSA ) y Enterococos resistentes a la vancomicina ( VRE ), entre otras bacterias Gram positivas y micoplasmas . [ 2 ] La bottromicina es estructuralmente distinta tanto de la vancomicina , un antibiótico glucopéptido , como de la meticilina , un antibiótico betalactámico .

La bottromicina se une al sitio A del ribosoma y bloquea la unión del aminoacil - ARNt , inhibiendo así la síntesis de proteínas bacterianas. [ 3 ] Aunque la bottromicina presenta actividad antibacteriana in vitro , aún no se ha desarrollado como antibiótico clínico, posiblemente debido a su escasa estabilidad en el plasma sanguíneo . [ 2 ] Para aumentar su estabilidad in vivo , se han explorado algunos derivados de la bottromicina. [ 2 ]

La estructura de la bottromicina contiene una amidina macrocíclica y un anillo de tiazol . La estereoquímica absoluta en varios centros quirales se determinó en 2009. [ 4 ] En 2012, se publicó una estructura tridimensional en solución de la bottromicina. [ 5 ] La estructura en solución reveló que varios grupos metilo se encuentran en la misma cara de la estructura.

La bottromicina pertenece a la clase de productos naturales peptídicos sintetizados ribosomalmente y modificados postraduccionalmente . [ 6 ]

Historia

La bottromicina se aisló por primera vez de Streptomyces bottropensis en 1957. [ 1 ] Desde entonces, se ha identificado en al menos otros dos miembros del género Streptomyces ; [ 6 ] [ 7 ] se sabe que los miembros de Streptomyces son productores prolíficos de metabolitos secundarios. [ 8 ] La bottromicina tiene una estructura única, que consiste en un enlace de amidina macrocíclico y cuatro aminoácidos β-metilados. La bottromicina bloquea la unión del aminoacil - ARNt al ribosoma al unirse al sitio A de la subunidad 50s. [ 3 ] Aunque la bottromicina se descubrió hace más de 50 años, hubo una falta de investigación después de los estudios iniciales sobre la bottromicina hasta los últimos años. La falta de investigación es potencialmente resultado de la baja estabilidad de la bottromicina en el plasma sanguíneo. [ 2 ] Sin embargo, la estructura única y el modo de acción han hecho recientemente que la bottromicina sea un objetivo más para el desarrollo de fármacos, especialmente dado el aumento de la resistencia a los antibióticos.

Mecanismo de acción

Esquema del mecanismo de acción de la bottromicina.

El mecanismo de acción de la bottromicina se confirmó casi 20 años después de su descubrimiento. [ 3 ] La bottromicina actúa como antibiótico mediante la inhibición de la síntesis de proteínas. Bloquea la unión del aminoacil - ARNt al ribosoma al unirse al sitio A de la subunidad 50S. Esto provoca la liberación del aminoacil - ARNt del ribosoma y la terminación prematura de la síntesis de proteínas. Una comparación con otros antibióticos conocidos por unirse al sitio A del ribosoma, como la micrococina, la tetraciclina , la estreptomicina y el cloranfenicol , sugirió que solo la bottromicina y el cloranfenicol causaban la liberación del aminoacil - ARNt del ribosoma. De estos antibióticos, solo la micrococina es también un péptido macrocíclico.

Determinación de la estructura

La bottromicina se produce de forma natural como una serie de productos que difieren en sus patrones de metilación. Todos los productos contienen metilación de valina y fenilalanina. La bottromicina A2 está metilada en una sola prolina, la bottromicina B carece de metilación en prolina y la bottromicina C contiene una prolina doblemente metilada.

Una estructura parcial de la bottromicina fue reportada poco después de su descubrimiento inicial. Los primeros estudios estructurales se basaron en métodos de análisis tradicionales. Su estructura peptídica , incluyendo la presencia de glicina y valina, fue sugerida por primera vez mediante una combinación de hidrólisis ácida , acetilación , tinción con ninhidrina y cromatografía en papel , entre otros experimentos. [ 9 ] La presencia de un anillo de tiazol, junto con una fenilalanina β-metilada adyacente, fue establecida por tinción con ninhidrina, oxidación con permanganato de potasio y comparación con estándares sintéticos. [ 10 ] Un sustituyente éster metílico fue reportado en 1958. [ 11 ] El mismo estudio también reportó que el producto de hidrólisis de Kunz que carecía de éster metílico era biológicamente inactivo. Nakamura y colegas reportaron más tarde que la bottromicina contenía tert-leucina y cis -3-metilprolina. [ 12 ] También propusieron una estructura de iminohexapéptido lineal. [ 13 ]

Estructura tridimensional en solución de la bottromicina A2, basada en datos de Gouda et al. [ 5 ] Oxígeno, azul brillante; nitrógeno, rojo; azufre, amarillo; cadena principal, verde

Estos primeros estudios estructurales no recibieron seguimiento hasta hace pocos años, con el renovado interés en la bottromicina. En las décadas de 1980 y 1990, se confirmó que la estructura era un iminopéptido cíclico, según estudios de RMN, con una cadena lateral lineal conectada al macrociclo mediante un enlace amidina. [ 14 ] [ 15 ]

Sin embargo, su estereoquímica absoluta no se caracterizó hasta 2009. [ 4 ] La estereoquímica en los carbonos 18 y 25 se propuso comparando los conformeros predichos obtenidos mediante dinámica molecular con las restricciones experimentales obtenidas mediante experimentos de RMN. La estereoquímica en el carbono 43 se confirmó comparando la RMN de 1H del producto de hidrólisis auténtico con una muestra sintetizada químicamente del mismo fragmento. Finalmente, los experimentos de rotación óptica, RMN de 1H y HRMS de la bottromicina sintetizada químicamente coincidieron con los de la bottromicina producida biológicamente.

La estructura tridimensional en solución de la bottromicina A2 se resolvió mediante RMN en 2012. [ 5 ] La estructura general se obtuvo con buena resolución (RMSD 0,74±0,59 Å), con un RMSD de 0,09±0,06 Å para el macrociclo. En este estudio, se propuso que el residuo de prolina metilada contribuía a la conformación restringida del macrociclo. Se encontró que los residuos de prolina metilada y β-OMe alanina estaban en la misma cara de la bottromicina A2 y se sugirió que esta característica contribuía a la unión de la bottromicina al sitio A ribosomal.

Biosíntesis

Se ha estudiado la producción de bottromicina por S. bottropensis y S. scabies , así como la producción de un análogo de bottromicina denominado bottromicina D. [ 6 ] [ 7 ] [ 16 ] [ 17 ] En 2012, varios grupos confirmaron de forma independiente que la bottromicina se produce como un péptido ribosómico natural que posteriormente se modifica postraduccionalmente. Antes de esto, no estaba claro si la bottromicina se producía mediante la maquinaria de la sintetasa de péptidos no ribosómicos (NRPS). La presencia de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos proteinogénicos es una característica frecuente de los productos de la NRPS, ya que la maquinaria NRPS puede incorporar directamente otros aminoácidos, entre otros bloques de construcción químicos. La síntesis de péptidos ribosómicos, que es la misma maquinaria que produce todas las proteínas de la célula, se limita a los 20 aminoácidos proteinogénicos. Sin embargo, mediante una combinación de minería genómica y estudios de deleción génica, se descubrió que la bottromicina es un péptido ribosómico altamente modificado. [ 7 ] [ 16 ]

En la síntesis de péptidos ribosomales, el producto final resulta de modificaciones a un material de partida peptídico lineal traducido por el ribosoma a partir de un transcrito de ARNm. En S. scabies, el péptido precursor, denominado BtmD, es un péptido de 44 aminoácidos. [ 7 ] El péptido precursor se denomina BmbC en S. bottropensis . [ 16 ] Los aminoácidos que forman el núcleo de la bottromicina son los residuos 2-9 en BtmD: Gly-Pro-Val-Val-Val-Phe-Asp-Cys. En la bottromicina D, la secuencia es Gly-Pro-Ala-Val-Val-Phe-Asp-Cys, y el péptido precursor se denomina BstA. [ 17 ] BstA comparte una alta homología de secuencia con BtmD en la región del péptido seguidor. A diferencia de otros productos naturales peptídicos ribosomales, que normalmente se sintetizan con un péptido líder que se escinde, la bottromicina se sintetiza con un péptido seguidor. La presencia de un péptido seguidor se identificó mediante análisis bioinformático del clúster biosintético de la bottromicina.

Grupo de genes biosintéticos de bottromicina anotados en S. bottropensis [ 16 ]

Se ha identificado el clúster génico biosintético completo de la bottromicina. Se predice que contiene 13 genes, incluido el péptido precursor (la notación seguirá a Crone y colaboradores; [ 7 ] otros estudios obtuvieron resultados similares). Se propone que uno de los genes del clúster, btmL , sea un regulador transcripcional . Se propone que otro gen, btmA , exporte la bottromicina. Se espera que los diez genes restantes modifiquen el péptido precursor btmD, transformándolo de un péptido lineal al producto macrocíclico final.

Se ha planteado una hipótesis sobre una vía biosintética basada en las funciones genéticas propuestas (véase la figura). Se predice que btmM , con homología a las aminopeptidasas Zn+2, escinde el residuo de metionina N-terminal, que no está presente en el producto final de la bottromicina. Tanto btmE como btmF contienen dominios similares a YcaO . Se cree que una Aunque no está claro qué enzima es responsable de cada paso, se plantea la hipótesis de que una cataliza la formación de amidina macrocíclica mientras que la otra cataliza la formación de tiazolina. btmJ , que codifica una enzima con homología al citocromo P450, puede oxidar la tiazolina a tiazol. btmH o btmI tienen homología a enzimas hidrolíticas (hidrolasa α/β e hidrolasa dependiente de metalo, respectivamente) que pueden catalizar la hidrólisis del péptido seguidor. Una función alternativa propuesta para btmH o btmI es la de ciclodeshidratasa en la macrociclación. Los estudios de deleción génica no lograron dilucidar la función de otras proteínas dentro del grupo. [ 7 ]

Ruta biosintética de la bottromicina propuesta por Crone et al.

Metiltransferasas en el grupo biosintético

El análisis bioinformático identificó cuatro metiltransferasas dentro del clúster. La bioinformática sugiere que btmB es una O- metiltransferasa , mientras que las otras tres, btmC , G y K , son metiltransferasas radicales de S -adenosilmetionina (SAM) . Se cree que las metiltransferasas radicales de SAM metilan los residuos de aminoácidos en el péptido precursor. Se cree que btmC metila la fenilalanina, btmG metila ambas valinas y btmK metila la prolina, según estudios de deleción génica. [ 6 ] [ 7 ]

Las tres presuntas metiltransferasas radicales de SAM codificadas dentro de la vía son interesantes tanto por razones mecanísticas como biosintéticas. Es probable que las metiltransferasas radicales de SAM metilen los sustratos mediante un mecanismo inusual. Biosintéticamente, las β-metilaciones de aminoácidos son muy inusuales en productos naturales. La politionamida B, un producto natural peptídico producido por un simbionte marino, es el único otro ejemplo caracterizado estructuralmente de β-metilación directa de un producto natural peptídico. La transferencia de metilo propuesta desde una enzima que utiliza SAM fue respaldada por estudios de alimentación anteriores con metionina marcada; se utiliza metionina marcada porque la metionina se convierte en SAM dentro de las células. [ 18 ] Más aún, este estudio utilizó metionina marcada estereoselectivamente ([metil-( 2 H- 3 H)]-(2 S , metil- R )-metionina) para mostrar que la metilación ocurrió con una retención neta de la estereoquímica en el grupo metilo. El autor especuló que la retención neta indicaba un mecanismo radical con un intermediario B12. [ 18 ] Se ha demostrado la transferencia radical con un cofactor de cobalamina B12 y SAM con las pocas metiltransferasas de SAM radicales caracterizadas. Aunque la evidencia apunta a la β-metilación radical durante la biosíntesis de bottromicina, queda por ver si la hipótesis bioinformática y los estudios de alimentación se verán respaldados por ensayos de actividad in vitro .

La sustitución Val3Ala en la bottromicina D no altera el patrón de β-metilación entre la bottromicina A2 y la D porque Val3 es la única valina no metilada en la bottromicina A2. Por lo tanto, todavía existen tres enzimas dependientes de radical SAM predichas en el clúster biosintético de la bottromicina D: bstC , bstF y bstJ . [ 17 ]

Hasta 2013, todos los estudios biosintéticos publicados se basaban en bioinformática o en cultivos celulares. Aún no se han publicado ensayos bioquímicos que demuestren directamente la función de las proteínas. Es probable que próximamente se publiquen estudios mecanísticos in vitro para dilucidar mejor la vía biosintética.

Síntesis total

Pasos clave seleccionados en la síntesis total de bottromicina reportados por Shimamura et al.

La síntesis total de bottromicina se logró en 2009. [ 4 ] La síntesis se logró en 17 pasos. Aunque la bottromicina es un producto natural basado en péptidos, contiene un macrociclo inusual y un heterociclo de tiazol, por lo que la síntesis total no pudo lograrse utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida tradicional . La síntesis se logró utilizando una combinación de acoplamiento de péptidos y otros métodos. Para obtener el intermedio primario tia-β-Ala-OMe, se realizó una secuencia de pasos de condensación, reacción de Mannich y descarboxilación catalizada por paladio. Este intermedio se preparó estereoselectivamente. Para obtener el enlace amidina, un intermedio tripéptido se acopló a una tioamida protegida con ftaloilo a través de una condensación mediada por mercurio utilizando trifluorometanosulfonato de mercurio (II) ( Hg(OTf) 2 ) para producir un intermedio amidina ramificado. Para obtener el macrociclo del producto final, fue necesaria la macrolactamización del intermedio que contenía amidina. La macrolactamización se realizó con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ( EDCI) e iPr₂NEt , obteniéndose el producto final, bottromicina A2. Para confirmar que la bottromicina A2 sintetizada tenía la misma estereoquímica que la bottromicina A2 natural, el producto se estudió mediante rotación óptica , RMN de ¹H y ¹³C , IR y HRMS. Los datos coincidieron con los de la bottromicina A2 aislada. Además, se observó que la muestra sintética de bottromicina presentaba actividad antibacteriana contra MRSA y VRE, aunque no se reportaron datos cuantitativos. El esquema de síntesis completo se puede consultar en el enlace del esquema de síntesis colapsado.

Los pasos clave en la síntesis de macrociclos alternativos reportados por Ackermann et al.

En 2012, se informó sobre una síntesis alternativa del sistema de anillo macrocíclico de bottromicina y el enlace amidina. [ 19 ] La síntesis se logró en 10 pasos. A diferencia de la síntesis anterior, Ackerman y sus colegas sintetizaron un péptido lineal y lograron la formación intramolecular de amidina utilizando un endotiopéptido S -metilado. El endotiopéptido se obtuvo mediante una reacción de tio-Ugi . El macrociclo resultante se obtuvo como una mezcla racémica en el enlace amidina. El esquema sintético completo puede consultarse en el enlace del esquema sintético colapsado.

Derivados

Una comparación de la bottromicina A2 con el derivado sintético de propilcetona [ 2 ] y con la bottromicina D. [ 17 ]

Tras la síntesis total de la bottromicina, Kobayashi y sus colegas sintetizaron una serie de derivados de la bottromicina y evaluaron su actividad anti-MRSA y anti-VRE. [ 2 ] Solo se exploraron derivados del grupo metil éster, ya que encontraron que este éster era importante para la actividad antibacteriana y, a la vez, inestable en el plasma sanguíneo. Se sintetizó una serie de diecisiete derivados, que se clasificaron en tres categorías generales: derivados de amida , derivados de urea y derivados de cetona . Todos los análogos, excepto los análogos de ácido carboxílico e hidrazida, se derivatizaron a partir de la bottromicina A2 aislada utilizando un éster de azida activado. Los derivados se probaron frente a seis cepas bacterianas Gram positivas: Staphylococcus aureus FDA209P, S. aureus Smith, MRSA HH-1, MRSA 92-1191, Enterococcus faecalis NCTC12201 y E. faecalis NCTC12203 (ambas VRE).

La bottromicina A2 mostró una actividad micromolar baja contra todas las cepas analizadas, con valores que oscilaron entre una CIM de 0,5 μg/mL en E. faecalis NCTC12203 y 2 μg/mL en MRSA HH-1. Se observó que las familias de derivados de amida y urea presentaban una actividad antibacteriana más débil que la bottromicina A2 contra S. aureus , MRSA y VRE. Los valores de CIM para los derivados de amida y urea fueron generalmente cuatro veces mayores que los de la bottromicina A2. Sin embargo, fueron significativamente más estables en plasma de ratón que la bottromicina A2. La bottromicina A2 se degradó completamente en plasma de ratón tras 10 minutos y mostró una actividad residual del 0% tras la exposición al suero de rata. Solo un derivado presentó una actividad residual inferior al 50%. En contraste, muchos derivados conservaron un porcentaje significativo de actividad residual anti-MRSA tras la exposición al suero. Se encontró que los intermedios tioéster de los derivados de cetona eran inestables, exhibiendo 0% de actividad residual, aunque tenían una actividad antibacteriana mejorada, exhibiendo valores de MIC submicromolares. Se encontró que la propilcetona era el derivado más prometedor de todos los análogos obtenidos, exhibiendo actividad antibacteriana contra las cepas bacterianas probadas y estabilidad en plasma, reteniendo 100% de actividad residual. Los valores de MIC obtenidos para el derivado de propilo fueron los mismos que los encontrados para la bottromicina A2 excepto en el caso de NCTC12201, que tuvo una MIC de 2 μg/mL para el derivado y una MIC de 1 μg/mL para la bottromicina A2. A continuación se muestra un resumen de los valores de MIC para las cepas bacterianas probadas.

Incluso los derivados de bottromicina menos activos mostraron mayor actividad anti-VRE que la vancomicina, utilizada como antibiótico de control en este estudio. El derivado propílico y la bottromicina A2 presentaron una actividad antimicrobiana similar a la del linezolid , un antibiótico sintético activo contra bacterias grampositivas, incluyendo SARM y VRE, en todas las cepas bacterianas estudiadas. En general, los resultados de este estudio sugieren que futuras modificaciones de la bottromicina podrían dar lugar a un antibiótico más estable y eficaz.

También se ha identificado un derivado natural de la bottromicina, la bottromicina D. [ 17 ] Se produce en una especie marina de Streptomyces , la cepa WMMB272. Aunque el éster metílico todavía está presente en la bottromicina D, una de las valinas macrocíclicas está mutada a una alanina. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) para la bottromicina D y se encontró que es solo ligeramente menos activa que la bottromicina A2 (2 μg/mL para la bottromicina D frente a 1 μg/mL para la bottromicina A2). Los autores postularon que una mayor flexibilidad conformacional de la bottromicina D podría ser responsable de su menor actividad.

Hasta 2013, no se habían publicado en la literatura estudios antibacterianos adicionales sobre derivados sintéticos o biosintéticos de bottromicina. La condición de bottromicina como péptido ribosomal facilita la búsqueda de análogos eficaces. Se pueden explorar análogos biosintéticamente modificando la secuencia del péptido precursor; un cambio en la secuencia de aminoácidos dará lugar directamente a una estructura de bottromicina modificada.

Potencial clínico

Hasta 2013, la bottromicina no había sido aprobada para ninguna aplicación clínica ni se había probado en humanos. Es necesario mejorar su estabilidad in vivo antes de que pueda considerarse como un fármaco candidato. El trabajo de Kobayashi y sus colegas ya ha comenzado a abordar este problema, pero es posible que se estén realizando más investigaciones. La necesidad de encontrar nuevos antibióticos para combatir la resistencia a los antibióticos implica que el interés en la bottromicina, tanto en el ámbito biológico como sintético, probablemente continuará. Una combinación de técnicas biológicas y sintéticas podría dar como resultado un análogo de bottromicina eficaz y estable para su desarrollo como posible fármaco candidato.

Véase también

Referencias

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