Microscopía de campo claro

La microscopía de campo claro ( BF ) es la más sencilla de todas las técnicas de iluminación para microscopía óptica . La muestra se ilumina mediante luz blanca transmitida (es decir, iluminada desde abajo y observada desde arriba) , y el contraste en la imagen se produce por la atenuación de la luz transmitida en las zonas densas de la muestra. La microscopía de campo claro es la más sencilla de las diversas técnicas utilizadas para iluminar muestras en microscopios ópticos, y su simplicidad la convierte en una técnica popular. La imagen típica de una microscopía de campo claro muestra una muestra oscura sobre un fondo brillante, de ahí su nombre.

Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620. ^{[ 2 ] [ 3 ]} Se desconoce quién fue el verdadero inventor del microscopio compuesto, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Estas incluyen una afirmación dudosa de que el fabricante de lentes holandés Zacharias Janssen inventó el microscopio compuesto y el telescopio ya en 1590. ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} Otra afirmación es que el competidor de Janssen, Hans Lippershey , quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608, también inventó el microscopio compuesto. ^{[ 8 ]} Otros historiadores señalan al innovador holandés Cornelis Drebbel , quien demostró un microscopio compuesto en Londres alrededor de 1621. ^{[ 9 ] [ 3 ]}

Galileo Galilei es citado a veces como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar su telescopio para observar objetos pequeños como moscas y/o mirar a través del extremo opuesto al revés para magnificar objetos pequeños. ^{[ 10 ] [ 11 ]} El único inconveniente era que su telescopio tenía que extenderse hasta seis pies para observar objetos tan cerca. ^{[ 12 ]}

Christiaan Huygens , otro holandés, desarrolló a finales del siglo XVII un sencillo sistema ocular de dos lentes con corrección acromática , lo que supuso un gran avance en el desarrollo del microscopio. El ocular de Huygens se sigue fabricando hoy en día, pero presenta un campo de visión reducido y otras pequeñas desventajas.

Se atribuye a Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) el haber dado a conocer el microscopio a los biólogos, aunque ya en el siglo XVI se fabricaban lentes de aumento simples. Los microscopios caseros de van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una sola lente muy pequeña pero potente. Eran incómodos de usar, pero le permitieron ver imágenes detalladas. Fueron necesarios unos 150 años de desarrollo óptico para que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar múltiples lentes. En la década de 1850, John Leonard Riddell , profesor de Química en la Universidad de Tulane , inventó el primer microscopio binocular práctico mientras realizaba una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera . ^{[ 13 ] [ 14 ]}

Un microscopio de campo claro tiene muchas partes importantes, entre ellas: el condensador, el objetivo, el ocular, el diafragma y la apertura. Otras partes comunes del microscopio son el brazo, el cabezal, el iluminador, la base, la platina, los ajustadores y el regulador de brillo. El condensador evita que la luz ambiental interfiera con el haz de luz y concentra la luz del iluminador para crear un haz uniforme. El objetivo y el ocular trabajan juntos; el ocular proporciona un aumento de diez veces y su número máximo es 400x, alcanzando un aumento total de hasta 4000x. La apertura, que forma parte del diafragma, controla el diámetro del haz que atraviesa la muestra. Los ajustadores mueven la platina hacia arriba y hacia abajo, en relación con el objetivo, el brazo, el cabezal y la base. ^{[ 15 ]}

Los microscopios de campo claro son muy fáciles de usar y permiten observar tanto muestras teñidas como sin teñir. Su sistema óptico no altera el color de la muestra, lo que facilita la interpretación de las observaciones.

La microscopía de campo claro es una técnica estándar de microscopía óptica y, por lo tanto, la magnificación está limitada por el poder de resolución posible con la longitud de onda de la luz visible . El límite práctico de magnificación con un microscopio óptico es de alrededor de 1300×. Son posibles mayores magnificaciones, pero se vuelve cada vez más difícil mantener la claridad de la imagen a medida que aumenta la magnificación. ^{[ 17 ]} Los microscopios de campo claro tienen una baja resolución óptica aparente debido al desenfoque del material fuera de foco;

Los microscopios de campo claro suelen producir un bajo contraste con la mayoría de las muestras biológicas, ya que pocas absorben mucha luz. Las muestras que son incoloras y transparentes por naturaleza no se ven bien, como por ejemplo muchos tipos de células de mamíferos. A menudo se requiere tinción para aumentar el contraste, lo que impide su uso en células vivas en muchas situaciones. La iluminación de campo claro es útil para muestras con color intrínseco, como las mitocondrias o para la observación del flujo citoplasmático en células de Chara .

• Comparación de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú (1,559 μm/píxel).
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  Iluminación de campo claro, el contraste de la muestra proviene de la absorción de luz en la muestra.
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  Iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
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  Iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.
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  Iluminación por contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

• Reducir o aumentar la cantidad de luz que incide sobre la lente mediante el diafragma de iris .
• Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite y un aceite de inmersión especial colocado sobre una cubierta de vidrio que cubre la muestra. El aceite de inmersión tiene la misma refracción que el vidrio y mejora la resolución de la muestra observada.
• Uso de métodos de tinción de muestras para su uso en microbiología , tales como tinciones simples ( azul de metileno , safranina , violeta cristal ) y tinciones diferenciales (tinciones negativas, tinciones flagelares, tinciones de endosporas).
• Se utiliza un filtro de color (generalmente azul) o polarizador en la fuente de luz para resaltar detalles que no son visibles bajo luz blanca. El uso de filtros es especialmente útil con muestras de minerales .

1. Microscopía óptica avanzada vol. 1 Principios y propiedades básicas por Maksymilian Pluta, Elsevier (1988)
2. Microscopía óptica avanzada vol. 2 Métodos especializados por Maksymilian Pluta, Elsevier (1989)
3. Introducción a la microscopía óptica por S. Bradbury, B. Bracegirdle, BIOS Scientific Publishers (1998)
4. Microbiología: Principios y exploraciones, por Jacquelyn G. Black, John Wiley & Sons, Inc. (2005)
5. Literatura sobre microscopía e imágenes
6. Van Helden, Albert; Dupré, Sven; Van Gent, Rob (2011). Los orígenes del telescopio . Prensa de la Universidad de Ámsterdam. ISBN 978-9069846156.