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En genética , el ADN complementario ( ADNc ) es ADN que se ha transcrito inversamente (mediante la transcriptasa inversa ) a partir de un ARN (por ejemplo, ARN mensajero o microARN ). El ADNc existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria, y tanto en formas naturales como modificadas genéticamente.
En formas modificadas, a menudo es una copia (réplica) del ADN que se produce naturalmente del genoma natural de un organismo en particular; el propio ARNm del organismo se transcribió naturalmente a partir de su ADN, y el ADNc se transcribe inversamente a partir del ARNm, produciendo una copia del ADN original. El ADNc modificado se usa a menudo para expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, expresión heteróloga ), o para secuenciar o cuantificar moléculas de ARNm usando métodos basados en ADN (qPCR, RNA-seq). El ADNc que codifica para una proteína específica se puede transferir a una célula receptora para su expresión como parte de ADN recombinante , a menudo sistemas de expresión bacterianos o de levadura. [ 1 ] El ADNc también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido masivo, células individuales o núcleos individuales en ensayos como microarrays , qPCR y RNA-seq .
En formas naturales, el ADNc es producido por retrovirus (como el VIH-1 , el VIH-2 , el virus de la inmunodeficiencia símica , etc.) y luego se integra en el genoma del huésped, donde crea un provirus . [ 2 ]
El término ADNc también se utiliza, normalmente en un contexto bioinformático , para referirse a la secuencia de una transcripción de ARNm, expresada en bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
La patentabilidad del ADNc fue objeto de una decisión de la Corte Suprema de los Estados Unidos en 2013 en el caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. Como solución de compromiso, la Corte declaró que el ADNc compuesto únicamente por exones es patentable, mientras que las secuencias aisladas de ADN natural que comprenden intrones no lo son.
Síntesis
El ARN sirve como plantilla para la síntesis de ADNc. [ 3 ] En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico diana . En biología molecular, el ARN se purifica a partir del material de origen después de eliminar el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. Posteriormente, el ADNc se sintetiza mediante transcripción inversa in vitro . [ 4 ]
purificación de ARN
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae mediante la lisis celular y posterior purificación del ARN utilizando métodos ampliamente utilizados como fenol-cloroformo, columna de sílice y métodos de extracción de ARN basados en perlas. [ 5 ] Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN de tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que, de otro modo, harían que el ARN fuera inutilizable. [ 6 ] Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como la DNasa y la proteinasa K para su degradación. [ 7 ] Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene inactivando las RNasas con agentes caotrópicos como isotiocianato de guanidinio, dodecilsulfato de sodio (SDS), fenol o cloroformo. El ARN total se separa de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN sencillas y rápidas para aplicaciones específicas. [ 8 ] Se pueden utilizar métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN (por ejemplo, ARNm y microARN ) según el tamaño o regiones únicas de ARN. [ 9 ] [ 10 ]
Transcripción inversa
Síntesis de la primera cadena
Utilizando una enzima transcriptasa inversa y plantillas de ARN purificadas, se produce una cadena de ADNc (síntesis de ADNc de primera cadena). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se usa comúnmente debido a su actividad reducida de RNasa H adecuada para la transcripción de ARN más largos. [ 11 ] La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también puede usarse para plantillas de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). [ 12 ] El ADNc se genera comúnmente a partir de ARNm para análisis de expresión génica como RT-qPCR y RNA-seq . [ 13 ] El ARNm se transcribe inversamente de forma selectiva utilizando cebadores oligo-d T que son el complemento inverso de la cola poliadenilada en el extremo 3' de todos los ARNm. El cebador oligo-dT se une a la cola poliadenilada del ARNm para servir como sitio de unión para que la transcriptasa inversa inicie la transcripción inversa. Una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores hexaméricos aleatorios aumenta la probabilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce el sesgo 5' o 3'. [ 14 ] El ARN ribosómico también puede agotarse para enriquecer tanto el ARNm como los transcritos no poliadenilados, como algunos ARN no codificantes . [ 15 ]
Síntesis de la segunda cadena
El resultado de las síntesis de la primera cadena, los híbridos ARN-ADN, se pueden procesar mediante múltiples métodos de síntesis de la segunda cadena o procesar directamente en ensayos posteriores. [ 16 ] [ 17 ] Un método temprano conocido como síntesis con cebado de horquilla se basaba en la formación de horquilla en el extremo 3' del ADNc de la primera cadena para cebar la síntesis de la segunda cadena. Sin embargo, el cebado es aleatorio y la hidrólisis de la horquilla conduce a la pérdida de información. El procedimiento de Gubler y Hoffman utiliza la RNasa H de E. coli para cortar el ARNm que se reemplaza con la ADN polimerasa I de E. coli y se sella con la ADN ligasa de E. coli . Una optimización de este procedimiento se basa en la baja actividad de la RNasa H de M-MLV para cortar el ARNm, y el ARN restante se elimina posteriormente añadiendo RNasa H después de la traducción de la ADN polimerasa de la segunda cadena del ADNc. Esto evita la pérdida de información de secuencia en el extremo 5' del ARNm.
Aplicaciones
El ADN complementario se utiliza frecuentemente en la clonación de genes , como sondas genéticas o en la creación de bibliotecas de ADNc . Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra para expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, se añade el ADNc a la célula receptora (en lugar del gen completo), ya que el ADN de un gen completo puede incluir fragmentos que no codifican la proteína o que interrumpen su secuencia codificante (por ejemplo, intrones ). A menudo se obtienen secuencias parciales de ADNc como etiquetas de secuencia expresada .
Con la amplificación de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica ya habitual, se suele realizar una transcripción inversa como paso inicial, seguida de una PCR para obtener una secuencia exacta de ADNc para su expresión intracelular. Esto se logra diseñando cebadores de ADN específicos que se hibridan con los extremos 5' y 3' de una región de ADNc que codifica una proteína. Una vez amplificada, la secuencia se puede cortar en ambos extremos con nucleasas e insertar en uno de los muchos vectores de expresión de ADN circulares pequeños. Estos vectores permiten la autorreplicación dentro de las células y, potencialmente, la integración en el ADN del huésped. Generalmente, también contienen un promotor fuerte que dirige la transcripción del ADNc diana a ARNm, que posteriormente se traduce en proteína.
El cDNA también se utiliza para estudiar la expresión génica mediante métodos como RNA-seq o RT-qPCR . [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] Para la secuenciación, el ARN debe fragmentarse debido a las limitaciones de tamaño de la plataforma de secuenciación. Además, el cDNA sintetizado de segunda cadena debe ligarse con adaptadores que permitan la amplificación por PCR de los fragmentos de cDNA y su unión a las celdas de flujo de secuenciación. Los métodos de análisis específicos de genes suelen utilizar microarrays y RT-qPCR para cuantificar los niveles de cDNA mediante métodos fluorométricos y otros.
El 13 de junio de 2013, la Corte Suprema de los Estados Unidos dictaminó en el caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, si bien los genes que ocurren de forma natural no pueden ser patentados , el ADNc sí es patentable porque no se produce de forma natural. [ 21 ]
Virus y retrotransposones
Algunos virus también utilizan ADNc para convertir su ARN viral en ARNm (ARN viral → ADNc → ARNm). El ARNm se utiliza para producir proteínas virales y así apoderarse de la célula huésped.
Un ejemplo de este primer paso, desde el ARN viral hasta el ADNc, se observa en el ciclo de infección del VIH. En este ciclo, la membrana de la célula huésped se une a la envoltura lipídica del virus, lo que permite que la cápside viral, con dos copias del ARN del genoma viral, entre en la célula huésped. La copia de ADNc se sintetiza mediante la retrotranscripción del ARN viral, un proceso facilitado por la chaperona CypA y una transcriptasa inversa asociada a la cápside viral. [ 22 ]
El ADNc también se genera mediante retrotransposones en los genomas eucariotas. Los retrotransposones son elementos genéticos móviles que se desplazan dentro de los genomas, y a veces entre ellos, a través de intermediarios de ARN. Este mecanismo es compartido con los virus, con la excepción de la generación de partículas infecciosas. [ 23 ] [ 24 ]
Véase también
- Biblioteca de ADNc – Tipo de biblioteca de ADN
- Microarray de ADNc : colección de puntos de ADN microscópicos adheridos a una superficie sólida. Páginas que muestran breves descripciones de los objetivos de redirección.
- Secuenciación de ARN (RNA-Seq ): técnica de laboratorio en biología celular.
- Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real : técnica de laboratorio de biología molecular (RT-qPCR)
Referencias
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Enlaces externos
- Base de datos H-Invitacional
- Anotación funcional de la base de datos del ratón
- Herramienta de ADN complementario
- http://news.icecric.com/today-match-prediction/ Archivado el 24 de octubre de 2021 en Wayback Machine
- ADN
