Agar de extracto de levadura y carbón activado tamponado

El agar de extracto de levadura y carbón activado tamponado (BCYE) es un medio de cultivo selectivo utilizado para cultivar ciertos tipos de bacterias , en particular la especie Gram-negativa Legionella pneumophila . ^{[ 1 ]} También se ha utilizado para el diagnóstico de laboratorio de la queratitis por Acanthamoeba , ^{[ 2 ]} Francisella y Nocardia spp . Contiene el aminoácido L-cisteína y pirofosfato férrico que ayudan al crecimiento de las especies de Legionnaire. El carbón activado dentro del medio actúa como desintoxicante porque descompone el peróxido de hidrógeno que es tóxico para las legionelas. El extracto de levadura en BCYE es la rica fuente de nutrientes (vitaminas, nitrógeno y carbono) de los que dependen las bacterias para crecer. BCYE también tiene un tampón ACES que mantiene un nivel de pH óptimo para el crecimiento de las bacterias que es alrededor de 6.9.El BCYE puede complementarse con antibióticos para seleccionar legionelas, especialmente si se analiza una muestra de agua ambiental o no potable.

* El pirofosfato férrico (soluble) debe mantenerse seco y en la oscuridad.

Preparación del agar BCYE - copiado de la Guía de laboratorio de los CDC para Legionella : ^{[ 4 ]}

1. Añadir el tampón ACES a 940 ml de agua destilada y disolver en un  baño de agua a 50 °C.
2. Añada lentamente suficiente KOH 1,0 N (unos 40 ml) a la solución tampón para elevar el pH a 6,9 y mezcle. (No utilice NaOH, ya que se ha comprobado que inhibe el crecimiento de Legionella pneumophila ).
3. En un segundo matraz, agregue carbón activado, extracto de levadura, alfa-cetoglutarato y agar. Mezcle los polvos secos.
4. Vierta la solución tampón en el segundo matraz que contiene los polvos secos y mezcle.
5. Calentar con cuidado para disolver el agar y, a continuación, esterilizar en autoclave a 121  °C durante 15 minutos.
6. Coloque inmediatamente el medio en  un baño de agua a 50 °C.
7. Para obtener un medio de cultivo completo, añada lentamente la solución de L-cisteína filtrada por membrana al medio y mezcle bien. La L-cisteína debe prepararse como una solución recién preparada.
8. Añada lentamente el pirofosfato férrico soluble filtrado por membrana y mezcle bien. No mezcle el hierro y la cisteína antes de añadirlos al medio, ya que la L-cisteína es un agente quelante.
9. Ajuste el pH del medio a 6,9 a temperatura ambiente. Dado que los reactivos pueden variar, cada laboratorio debe determinar la cantidad de KOH necesaria. Mantenga el medio preparado a 50  °C, vierta una muestra de 10 mL y compruebe el pH a temperatura ambiente. Si es necesario, ajuste el medio con KOH 1,0 N o HCl 1,0 N. Tenga en cuenta que el pKa del tampón ACES es 6,9 a 20  °C y 6,8 a 25  °C. Su pKa se ve afectado por la temperatura (0,02 unidades de pH/°C). Sin embargo, una vez que el agar se ha solidificado, el pH no parece cambiar con la temperatura, sino que permanece en 6,9.
10. Para la preparación de BCYE + antibióticos, agregue los antibióticos filtrados por membrana y mezcle.
11. Para el agar BCYE + albúmina, disuelva la albúmina en agua destilada y esterilícela por filtración antes de añadirla al medio.
12. Dispensar 20 ml por placa de Petri de 15 x 100 mm.

El medio debe mezclarse con frecuencia durante el vertido para mantener las partículas de carbón en suspensión. Una vez solidificado el medio, las placas deben guardarse en bolsas de plástico en el refrigerador, en la oscuridad. Las placas preparadas deberían conservarse durante aproximadamente 4 meses, siempre que superen el control de calidad. ^{[ 4 ]}

Resultados esperados:

Las bacterias Legionella , que suelen ser lisas e incoloras, de color azul o gris, se vuelven más blancas y filamentosas con el tiempo y adquieren fluorescencia verde y amarilla bajo luz ultravioleta. La superficie de la colonia es generalmente lisa, pero al observarla al microscopio puede presentar estrías que le dan una apariencia similar a la de un huevo frito.

Almacenamiento de placas BCYE:

Las placas de BCYE deben almacenarse en la oscuridad a temperaturas de 2 a 8 grados Celsius. No deben congelarse ni sobrecalentarse; la exposición a la luz debe ser mínima. Al igual que la mayoría de los medios de cultivo, el BCYE no debe abrirse a menos que se vaya a utilizar y debe estar a temperatura ambiente antes de inocular cualquier microorganismo en el medio.