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Articulo de referencia

Transformación del cloruro de calcio

La transformación con cloruro de calcio ( CaCl₂ ) es una técnica de laboratorio en biología celular procariota (bacteriana) . [ 1 ] La adición de cloruro de calcio a una suspens...

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La transformación con cloruro de calcio ( CaCl₂ ) es una técnica de laboratorio en biología celular procariota (bacteriana) . [ 1 ] La adición de cloruro de calcio a una suspensión celular promueve la unión del ADN plasmídico a los lipopolisacáridos (LPS). Los iones de calcio con carga positiva atraen tanto la cadena principal del ADN con carga negativa como los grupos con carga negativa en el núcleo interno del LPS. El ADN plasmídico puede entonces pasar al interior de la célula tras un choque térmico , donde las células refrigeradas (+4 °C) se calientan a una temperatura más alta (+42 °C) durante un breve período.

Historia de la transformación bacteriana

Frederick Griffith publicó el primer informe sobre el potencial de transformación de las bacterias en 1928. [ 2 ] Griffith observó que los ratones no sucumbían al tipo "rugoso" de neumococo ( Streptococcus pneumoniae ), denominado no virulento, pero sí a la cepa "lisa", denominada virulenta. La virulencia de la cepa lisa podía suprimirse mediante la inactivación por calor. Sin embargo, cuando la cepa rugosa no virulenta se combinaba con la cepa lisa inactivada por calor, la cepa rugosa lograba adquirir el fenotipo liso y, por lo tanto, volverse virulenta. La investigación de Griffith indicó que el cambio era provocado por una sustancia no viva y termoestable generada a partir de la cepa lisa. Posteriormente, Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty identificaron esta sustancia transformadora como ADN en 1944. [ 3 ]

Principio de transformación del cloruro de calcio

Dado que el ADN es una molécula muy hidrofílica , a menudo no puede penetrar la membrana celular bacteriana . Por lo tanto, es necesario que las bacterias sean competentes para internalizar el ADN . Esto se puede lograr suspendiendo las bacterias en una solución con una alta concentración de calcio , lo que crea pequeños orificios en las células bacterianas . La suspensión de calcio, junto con la incubación del ADN con células competentes en hielo, seguida de un breve choque térmico, provocará que el ADN extracromosómico entre directamente en la célula. [ 4 ]

Según investigaciones previas, las moléculas receptoras de LPS en la superficie de la célula competente se unen a una molécula de ADN desnuda . [ 1 ] Esta unión se produce cuando las moléculas de ADN con carga negativa y el LPS forman complejos de coordinación con los cationes divalentes. Debido a su tamaño, el ADN no puede atravesar la membrana celular por sí solo para llegar al citoplasma . La membrana celular de las células tratadas con CaCl₂ se despolariza severamente durante la etapa de choque térmico y, como resultado, la caída del potencial de membrana reduce la naturaleza negativa del potencial interno de la célula, permitiendo que el ADN con carga negativa fluya hacia el interior de la célula. Posteriormente, el potencial de membrana puede volver a su valor inicial mediante un choque térmico posterior. [ 4 ]

Células competentes

Las células competentes son células bacterianas con paredes celulares rediseñadas que facilitan el paso del ADN extraño. Sin tratamientos químicos o eléctricos específicos que las hagan capaces, la mayoría de los tipos celulares no pueden incorporar ADN con éxito ; por esta razón, el tratamiento con iones de calcio es el procedimiento típico para modificar las bacterias y hacerlas permeables al ADN. [ 5 ] En las bacterias, la competencia está estrictamente regulada, y las diferentes especies bacterianas presentan distintas características relacionadas con la competencia. Aunque comparten algunas similitudes, las proteínas de competencia generadas por las bacterias Gram positivas y Gram negativas son diferentes. [ 6 ]

Competencia natural

La competencia natural se resume en tres métodos mediante los cuales las bacterias pueden adquirir ADN de su entorno: conjugación , transformación y transducción . [ 7 ] Dado que el ADN se inserta en la célula durante la transformación, las células receptoras deben encontrarse en una condición fisiológica determinada, conocida como estado competente, para poder incorporar el ADN transformante . [ 6 ] Una vez que el ADN ha entrado en el citoplasma celular, enzimas como la nucleasa pueden degradarlo. En los casos en que el ADN es extremadamente similar al material genético de la propia célula, las enzimas reparadoras de ADN lo recombinan con el cromosoma. [ 8 ]

Competencia artificial

Evidentemente, los genes de una célula no incluyen información sobre competencia artificial. Este tipo de competencia requiere un proceso de laboratorio que crea condiciones que no suelen existir en la naturaleza para que las células puedan volverse permeables al ADN . [ 9 ] Aunque la eficiencia de la transformación suele ser baja, este proceso es relativamente simple y rápido de aplicar en la ingeniería genética bacteriana. Mandel y Higa, [ 10 ] quienes crearon un procedimiento sencillo basado en sumergir las células en CaCl 2 frío , sentaron las bases para obtener células competentes sintéticas. La transformación química, como la transformación con cloruro de calcio y la electroporación, son los métodos más utilizados para transformar células bacterianas, como las células de E. coli , con ADN plasmídico . [ 5 ]

Método para la transformación del cloruro de calcio

El tratamiento con cloruro de calcio se utiliza generalmente para la transformación de E. coli y otras bacterias. [ 11 ] Mejora la incorporación de ADN plasmídico por la célula bacteriana, promoviendo la transformación genética . El ADN plasmídico puede unirse al LPS al añadirse a la solución celular junto con CaCl₂ . [ 12 ] Por lo tanto, cuando se aplica un choque térmico, la estructura del ADN con carga negativa y el LPS se combinan, permitiendo que el ADN plasmídico entre en la célula bacteriana. [ 13 ]

El proceso se resume en los siguientes pasos según el protocolo de la revista The Undergraduate Journal of Experimental Microbiology and Immunology (UJEMI) :

  1. Prepara un cultivo bacteriano en caldo LB.
  2. Antes de comenzar el procedimiento principal, utilice el volumen necesario del cultivo previamente preparado para inocular el volumen necesario de caldo LB fresco.
  3. Centrifugue las células a 4  °C a 4000 rpm durante 10 minutos para obtener un precipitado celular.
  4. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 20 ml de CaCl₂ 0,1 M helado , luego déjelo inmediatamente en hielo durante 20 minutos.
  5. Centrifugar como en el paso 3, se obtendrá un sedimento más difuso como indicación de células competentes.
  6. Resuspender en CaCl2 frío como en el paso 4.
  7. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 5 ml de CaCl₂ 0,1 M helado junto con 15 % de glicerol para combinar los precipitados.
  8. Transfiera las suspensiones a tubos de vidrio delgados y estériles para lograr choques térmicos efectivos.
  9. Añada la cantidad necesaria de ADN (en mg) a los tubos de suspensión y déjelos inmediatamente en hielo.
  10. Coloque los tubos en un  baño de agua a 42 °C durante 30 segundos y vuelva a colocarlos inmediatamente en hielo durante 2 minutos.
  11. Agregue 1 ml de medio LB o SOC.
  12. Transfiera cada tubo a la cantidad requerida de caldo LB en mL en un matraz nuevo.
  13. Incubar adecuadamente con agitación a 37  °C a 200 rpm durante 60 minutos; sin embargo, se recomienda dejarlo durante 90 minutos para permitir que las bacterias se recuperen.
  14. Siembra diluciones 1:10 y 1:100 de los cultivos incubados en placas selectivas/de cribado (p. ej., ampicilina y/o X-gal) sobre placas LB a las que se han añadido los antibióticos que se utilizarán para la selección.
  15. Incubar durante la noche a 37  °C.
  16. Finalmente, observe las colonias aisladas en las placas.

Referencias

  1. 1 2 Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "La incubación prolongada en cloruro de calcio mejora la competencia de las células de Escherichia coli". Gene . 6 (1): 23– 28. doi : 10.1016/0378-1119(79)90082-9 . PMID 383576 . 
  2. ↑ Griffith, Fred (enero de 1928). " La importancia de los tipos de neumococo" . Journal of Hygiene . 27 (2): 113– 159. doi : 10.1017/s0022172400031879 . ISSN 0022-1724 . PMC 2167760. PMID 20474956. S2CID 44003929 .    
  3. ↑ Avery, Oswald T.; MacLeod, Colin M.; McCarty, Maclyn (mayo de 1995). "Estudios sobre la naturaleza química de la sustancia que induce la transformación de los tipos de neumococo" . Medicina molecular . 1 (4): 344– 365. doi : 10.1007/bf03401572 . ISSN 1076-1551 . PMC 2229990. PMID 8521292 .   
  4. 1 2 " Técnica de transformación de CaCl 2 " . Centro de aprendizaje MyBioSource . Consultado el 4 de enero de 2023 .
  5. 1 2 Fregel, R.; Rodríguez, V.; Cabrera, VM (abril de 2008). "Transformación mejorada de Escherichia coli mediante microondas" . Letters in Applied Microbiology . 46 (4): 498– 499. doi : 10.1111/j.1472-765X.2008.02333.x . ISSN 0266-8254 . PMID 18284557. S2CID 14569911 .   
  6. 1 2 Seitz, Patrick; Blokesch, Melanie (2013). "Señales y vías reguladoras involucradas en la competencia natural y la transformación en bacterias Gram negativas patógenas y ambientales" . FEMS Microbiology Reviews . 37 (3): 336– 363. doi : 10.1111/j.1574-6976.2012.00353.x . PMID 22928673. S2CID 30861416 .  
  7. ↑ Fischer, Wolfgang; Hofreuter, Dirk; Haas, Rainer (2014-04-09), "Transformación natural, recombinación y reparación" , Helicobacter pylori , Washington, DC, EE. UU.: ASM Press, págs. 249–257 , doi : 10.1128/9781555818005.ch22 , ISBN  9781683672388, recuperado el 4 de enero de 2023
  8. ↑ " Ciencia biológica . Quinta edición. Volumen 1: La célula, genética y desarrollo. Por Scott Freeman, Lizabeth Allison, Michael Black, Greg Podgorski, Kim Quillin, Jon Monroe y Emily Taylor. Boston (Massachusetts): Pearson. $85.20 (tapa blanda). xxxi + 443 p.; il.; A:1–A:52; B:1–B:30; C:1; G:1–G:39; Cr:1–Cr:9; I:1–I:42 (índice). ISBN 978-0-321-84180-3. 2014" . The Quarterly Review of Biology . 88 (4): 329. Diciembre de 2013. doi : 10.1086/673770 . ISSN 0033-5770 . 
  9. ↑ Yoshida, Naoto; Sato, Misa (julio de 2009). "Captación de plásmidos por bacterias: una comparación de métodos y eficiencias" . Microbiología Aplicada y Biotecnología . 83 (5): 791– 798. doi : 10.1007/s00253-009-2042-4 . ISSN 0175-7598 . PMID 19471921. S2CID 24211143 .   
  10. ↑ Mandel, M.; Higa, A. (octubre de 1970). "Infección por ADN de bacteriófagos dependiente de calcio" . Journal of Molecular Biology . 53 (1): 159– 162. doi : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . ISSN 0022-2836 . PMID 4922220 .  
  11. ↑ Higuchi-Takeuchi, Mieko; Morisaki, Kumiko; Numata, Keiji (enero de 2020). "Método para la transformación sencilla de bacterias fotosintéticas púrpuras marinas utilizando células químicamente competentes" . MicrobiologyOpen . 9 ( 1): e00953. doi : 10.1002/mbo3.953 . ISSN 2045-8827 . PMC 6957439. PMID 31638342 .   
  12. ↑ Hanahan, Douglas (junio de 1983). "Estudios sobre la transformación de Escherichia coli con plásmidos" . Journal of Molecular Biology . 166 (4): 557– 580. doi : 10.1016/s0022-2836(83)80284-8 . ISSN 0022-2836 . PMID 6345791 .  
  13. ^ Nakata, Yasuhiko; Tang, Xiaoren; Yokoyama, Kazunari K. (1996), "Preparación de células competentes para la transformación de plásmidos de alta eficiencia de Escherichia coli" , Protocolos de biblioteca de ADNc , vol. 69, Nueva Jersey: Humana Press, págs. 129–138 , doi : 10.1385/0-89603-383-x:129 , ISBN   0-89603-383-XPMID 9116846 , consultado el 4 de enero de 2023 
  • Animación de la transformación del cloruro de calcio ( CaCl₂ )
  • https://www.youtube.com/watch?v=7Ul9RVYG5CM&ab_channel=NewEnglandBiolabs