Análisis de la expresión génica mediante la técnica de la tapa

El análisis de la expresión génica mediante la técnica CAGE ( Cap analysis of gene expression ) es una técnica de expresión génica utilizada en biología molecular para producir una instantánea del extremo 5' de la población de ARN mensajero en una muestra biológica (el transcriptoma ). Los pequeños fragmentos (históricamente de 27 nucleótidos de longitud, pero ahora limitados solo por las tecnologías de secuenciación) de los inicios de los ARNm (extremos 5' de los transcritos con caperuza ) se extraen, se transcriben inversamente a ADNc, se amplifican mediante PCR (si es necesario) y se secuencian . CAGE fue publicado por primera vez por Hayashizaki, Carninci y colaboradores en 2003. ^{[ 1 ]} CAGE se ha utilizado ampliamente dentro de los proyectos de investigación FANTOM .

El resultado de CAGE es un conjunto de secuencias cortas de nucleótidos (a menudo llamadas etiquetas, por analogía con las etiquetas de secuencias expresadas ) con sus recuentos observados. El número de copias de las etiquetas CAGE proporciona una cuantificación digital de la abundancia de transcritos de ARN en muestras biológicas. Utilizando un genoma de referencia, un investigador generalmente puede determinar, con cierta precisión, el ARNm original (y, por lo tanto, de qué gen ) se extrajo la etiqueta.

A diferencia de la técnica similar de análisis serial de la expresión génica (SAGE), en la que las etiquetas provienen de otras partes de los transcritos, CAGE se utiliza principalmente para localizar los sitios exactos de inicio de la transcripción en el genoma. Este conocimiento, a su vez, permite al investigador estudiar la estructura del promotor necesaria para la expresión génica.

Las etiquetas CAGE tienden a comenzar con una guanina (G) adicional que no está codificada en el genoma, lo cual se atribuye a la extensión 5′ sin plantilla durante la síntesis de ADNc de primera cadena ^{[ 2 ]} o a la retrotranscripción de la propia caperuza. ^{[ 3 ]} Si no se corrige, esto puede inducir un mapeo erróneo de las etiquetas CAGE, por ejemplo, a pseudogenes no transcritos. ^{[ 2 ]} Por otro lado, esta adición de G también se utilizó como señal para filtrar picos TSS más fiables. ^{[ 4 ]}

El método CAGE original (Shiraki et al. , 2003) ^{[ 1 ]} utilizaba CAP Trapper ^{[ 5 ]} para capturar los extremos 5′, cebadores oligo-dT para sintetizar los cDNA, la enzima de restricción tipo IIs MmeI para cortar las etiquetas y el método Sanger para secuenciarlos.

Los cebadores de transcripción inversa aleatorios fueron introducidos en 2006 por Kodzius et al. ^{[ 6 ]} para detectar mejor los ARN no poliadenilados.

En DeepCAGE (Valen et al. , 2008), ^{[ 7 ]} los concatémeros de etiquetas se secuenciaron a un mayor rendimiento en la plataforma de secuenciación de " próxima generación " 454 .

En 2008, se añadió la multiplexación de códigos de barras al protocolo DeepCAGE (Maeda et al. , 2008). ^{[ 8 ]}

En nanoCAGE (Plessy et al. , 2010), ^{[ 9 ]} los extremos 5′ o ARN se capturaron con el método de cambio de plantilla en lugar de CAP Trapper, para analizar cantidades iniciales más pequeñas de ARN total. Las etiquetas más largas se cortaron con la enzima de restricción tipo III EcoP15I y se secuenciaron directamente en la plataforma Solexa (luego Illumina) sin concatenación.

La metodología CAGEscan (Plessy et al. , 2010), ^{[ 9 ]} donde se omite la escisión de la etiqueta enzimática y los cDNA 5′ se secuencian en pares de extremos , se introdujo en el mismo artículo para conectar promotores nuevos con anotaciones conocidas.

Con HeliScopeCAGE (Kanamori-Katayama et al. , 2011), ^{[ 10 ]} el protocolo CAGE con trampa CAP se modificó para omitir la escisión de la etiqueta enzimática y secuenciar directamente los extremos 5′ con caperuza en la plataforma HeliScope , sin amplificación por PCR. Posteriormente, Itoh et al. ^{[ 11 ]} lo automatizaron en 2012.

En 2012, Takahashi et al. ^{[ 12 ]} actualizaron el protocolo CAGE estándar para cortar las etiquetas con EcoP15I y secuenciarlas en la plataforma Illumina-Solexa.

En 2013, Batut et al. ^{[ 13 ]} combinaron el atrapador CAP, el cambio de plantilla y la digestión con exonucleasa dependiente de 5′-fosfato en RAMPAGE para maximizar la especificidad del promotor.

En 2014, Murata et al. ^{[ 14 ]} publicaron el protocolo nAnTi-CAGE , donde los extremos 5′ con caperuza se secuencian en la plataforma Illumina sin amplificación por PCR ni escisión de etiquetas.

En 2017, Poulain et al. ^{[ 15 ]} actualizaron el protocolo nanoCAGE para utilizar el método de tagmentación (basado en la transposición de Tn5 ) para la multiplexación.

En 2018, Cvetesic et al. ^{[ 16 ]} aumentaron la sensibilidad de CAP-trapped CAGE mediante la introducción de ARN portador selectivamente degradable (SLIC-CAGE, "Super-Low Input Carrier-CAGE").

En 2021, Takahashi et al. ^{[ 17 ]} simplificaron la secuenciación de bibliotecas CAGE en secuenciadores Illumina omitiendo la síntesis de la segunda hebra y cargando directamente ADNc de cadena simple (CAGE de cadena simple de baja cantidad, "LQ-ssCAGE").

En 2025, Delobel et al. ^{[ 18 ]} actualizaron el protocolo nAnTi-CAGE para introducir una indexación dual única, para mitigar los artefactos de salto de índice que son más frecuentes en las celdas de flujo con patrones utilizadas en los instrumentos Illumina de 2 colores.

• Análisis serial de la expresión génica
• Secuenciación de ARN
• Transcriptómica

• Página principal de CAGE en el Centro de Ciencias Ómicas de RIKEN .
• Página de protocolos en el sitio web de FANTOM5.