Cas3

Cas3 consta de un dominio nucleasa HD fusionado a dos dominios similares a RecA . Estos dominios permiten la translocación y degradación de ADN monocatenario dependiente de ATP. Una hélice expuesta y residuos de tirosina/triptófano ubicados en el dominio RecA-HD son esenciales para la funcionalidad de este mecanismo. Además, la función nucleasa está respaldada por iones metálicos como hierro, manganeso y calcio, que regulan las interacciones entre Cas3 y Cascade. ^{[ 5 ]}

La validación de las secuencias de ADN diana por Cascade es esencial para la eficacia de Cas3 como nucleasa en los sistemas CRISPR. Este proceso se logra mediante la identificación de un motivo adyacente al protoespaciador en un sitio diana, seguido de la formación de un bucle R de Cascade que se une al ADN diana. Esta estructura permite que Cas3 se cargue en el ADN monocatenario y permita interacciones con la subunidad Cse1 de los canales Cascade. Específicamente, Cas3 se acopla a la hélice alfa H1 de Cse1, lo que desencadena la degradación del ADN diana por la actividad de la nucleasa HD de Cas3. Esta degradación se logra mediante la incisión del ADN por la nucleasa HD en el bucle R, lo que desplaza el ADN monocatenario. Los dominios RecA impulsan la translocación de Cas3 dependiente de ATP a lo largo del ADN monocatenario. ^{[ 5 ]}

Tras la unión de Cas3 al ADN monocatenario y su translocación dependiente de ATP, se produce la actividad helicasa. La helicasa Cas3 puede separar las hebras de ADN bicatenario y posiblemente desplazar otras proteínas del ADN durante la translocación. Este proceso tiene lugar cuando Cas3 se transloca alejándose de Cascade, mientras que Cascade permanece unido al sitio diana. ^{[ 5 ]}

El extremo C-terminal de Cas3 contiene motivos característicos de las helicasas de la superfamilia 2 del subgrupo DExD/H . Se ha demostrado que dominios similares reclutan proteínas y complejos asociados, y es posible que el dominio terminal de Cas3 tenga la misma función. Se han identificado nueve dominios conservados (Q, I, Ia, Ib y II-VI) en las helicasas de tipo DExD/H de la superfamilia 2. Estos dominios permiten que las helicasas dependientes de ATP transloquen o remodelen ácidos nucleicos. Cas3 presenta actividad ATPasa dependiente de ADN monocatenario, que requiere iones Mg2+ para su funcionamiento. Además, la actividad de desenrollamiento de Cas3 también depende de la concentración de proteínas y de la presencia de ATP. ^{[ 6 ]}

La destrucción del ADN catalizada por Cas3 desempeña un papel importante en las reacciones de edición genética. Cas3, cuando se compleja con Cascade, puede funcionar en inserciones y deleciones genéticas dirigidas al ser introducida en las células como proteínas con señales de localización nuclear. Debido a que Cascade debe unirse al ADN diana antes de la activación de Cas3, la tasa de efectos fuera de diana es baja. Se ha demostrado que Cas3 facilita la deleción de grandes regiones genéticas, de hasta 200 kb, cuando se expresa en células HEK293 humanas. Además, la capacidad de Cas3 para saltar exones resulta prometedora para futuros tratamientos de terapia genética para afecciones como la distrofia muscular. ^{[ 5 ]}

En comparación con las capacidades de edición genética a gran escala de Cas3, las enzimas CRISPR-Cas9 y Cas12a , líderes en la actualidad , presentan limitaciones en sus intervenciones. Estas enzimas producen pequeñas deleciones y mutaciones puntuales. Por otro lado, un sistema Cascade-Cas3 puede utilizarse para realizar deleciones mucho mayores con alta eficiencia. Esto se logra gracias a las capacidades únicas de Cas3, que permiten deleciones bidireccionales desde un mismo sitio de corte. Además, estas capacidades bidireccionales permiten realizar deleciones rápidas en comparación con otras enzimas. ^{[ 7 ]}

La inmunidad adaptativa mediada por CRISPR requiere tres etapas: adquisición de secuencia, biogénesis del ARN CRISPR e interferencia con el objetivo. Los complejos de vigilancia guiados por ARN CRISPR ayudan a este proceso a dirigirse eficazmente a lo ajeno mediante el reconocimiento de motivos cortos. Los sistemas de tipo IE, que utilizan Cas3, emplean Cascade como complejo de vigilancia en este proceso. Mediante la unión y el plegamiento de Cascade al ADN objetivo, se forman bucles R y Cas3 se incorpora al complejo. ^{[ 8 ]}

El ATP potencia el reclutamiento de Cas3 a los bucles R, y su unión aumenta la actividad ATPasa de Cas3. El dominio nucleasa HD de Cas3 corta y degrada unidireccionalmente el ADN diana de la hebra desplazada en dirección 3' a 5'. La degradación mediada por Cas3 también puede reclutar a Cas1 y Cas2 , proteínas implicadas en el proceso de integración de espaciadores, preparando así la respuesta inmunitaria contra agentes extraños. ^{[ 8 ]}