Cas4

Cas4 es una endonucleasa presente en algunos sistemas CRISPR que se utiliza como parte de la etapa de adquisición del espaciador. Las proteínas de la familia Cas4 pertenecientes a la arquea Sulfolobus solfataricus utilizan cuatro residuos de cisteína para unirse a un grupo hierro-azufre similar al de la nucleasa AddB de Bacillus subtilis . ^{[ 1 ]} La proteína Sso0001 de la familia Cas4 codifica una exonucleasa de ADN monocatenario de 5' a 3' que in vitro se detiene por aductos de ADN extrahelicoidales. ^{[ 1 ]} Cas4 funciona para resecar y generar extremos de ADN monocatenario recombinogénicos en la cadena de ADN dúplex. ^{[ 1 ]}

Cas4 captura y almacena fragmentos cortos de ADN llamados "espaciadores" de diferentes elementos en matrices CRISPR genómicas del huésped para mantener la inmunidad contra virus y elementos móviles extraños. ^{[ 2 ]} Todos los sistemas CRISPR-Cas reconocen y cortan los "protoespaciadores" al tamaño correcto mientras los unen a las matrices CRISPR genómicas en la orientación correcta. ^{[ 2 ]} Los "protoespaciadores" son reconocidos por un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) flanqueante de 2 a 5 pb para orientarse e insertarse en las matrices CRISPR. ^{[ 2 ]} Cas4 corta aguas arriba de las secuencias PAM para asegurar que los espaciadores sean funcionales. ^{[ 3 ]} La orientación de los espaciadores ocurre durante la integración virtuosística con frecuencias similares a las de las proteínas Cas1 y Cas2. La orientación correcta es altamente favorecida in vivo para funcionar en el reconocimiento del objetivo. ^{[ 2 ]}

La proteína Cas4 es una proteína principal para CRISPR, ya que previene la formación de espaciadores no funcionales y garantiza la fidelidad del ajuste. ^{[ 4 ]} CRISPR-Cas es una reserva inmune adaptativa para mantenerse al día con elementos genéticos móviles en evolución, como plásmidos y bacteriófagos. ^{[ 5 ]} CRISPR-Cas tiene tres etapas a través de la inmunidad: adaptación, expresión e interferencia. ^{[ 4 ]} Cas4 exhibe desenrollamiento de ADN, actividad exonucleasa y endonucleasa. ^{[ 4 ]} Se utilizan dos proteínas Cas4 para coordinar el reconocimiento de PAM, el recorte del preespaciador y la eliminación del saliente 3', y la integración de los ADN espaciadores en la matriz CRISPR que se orienta para dar como resultado un crRNA funcional que interactúa con el ADN objetivo para la inmunidad CRISPR. ^{[ 2 ]} La matriz es una fuente de ARN pequeños que guían los complejos de nucleasa Cas hacia sus objetivos. ^{[ 5 ]}

Cas4 es necesario para el procesamiento eficiente del preespaciador mediante la formación de un complejo Cas4- Cas1 - Cas2 . ^{[ 3 ]} En este complejo, Cas4 corta sustratos de doble cadena con largos salientes 3' a través de una escisión endonucleolítica específica del sitio. ^{[ 4 ]} Cas4 interactúa estrechamente con los sitios activos de la integrasa de Cas1 , reconoce secuencias PAM dentro del sustrato y corta precisamente aguas arriba de ellas, asegurando la adquisición de espaciadores funcionales. ^{[ 4 ] [ 3 ]} Cas4 actúa como una nucleasa y un punto de control molecular dentro de la maquinaria de adaptación. ^{[ 3 ]} La proteína Cas4 con Cas1-Cas2 permite que se incorporen secuencias compatibles con interferencia aguas abajo. ^{[ 3 ]}