Catecol oxidasa

La catecol oxidasa es una oxidasa de cobre que contiene un cofactor de dicobre tipo 3 y cataliza la oxidación de orto- difenoles a orto- quinonas acoplada a la reducción de oxígeno molecular a agua. Está presente en una variedad de especies de plantas y hongos, incluyendo Ipomoea batatas ( boniato ) ^{[ 1 ]} y Camellia sinensis (hoja de té india). ^{[ 2 ]} Las metaloenzimas con centros de cobre tipo 3 se caracterizan por su capacidad de unirse reversiblemente al dioxígeno en condiciones ambientales. ^{[ 3 ]} En las plantas, la catecol oxidasa juega un papel clave en el pardeamiento enzimático al catalizar la oxidación del catecol a o-quinona en presencia de oxígeno, que puede polimerizarse rápidamente para formar la melanina que da a los frutos dañados su color marrón oscuro.

Las polifenol oxidasas son una familia de metaloenzimas de dicobre que incluyen la tirosinasa y la catecol oxidasa. ^{[ 4 ]} En las plantas, ambas enzimas pueden catalizar la oxidación de sustratos orto-difenoles a sus correspondientes orto-quinonas. La diferencia clave entre estas dos enzimas relacionadas es que la tirosinasa puede catalizar la hidroxilación de monofenoles a difenoles (actividad monofenolasa), así como la oxidación del o-difenol a la o-quinona (actividad difenolasa), mientras que la catecol oxidasa solo posee actividad difenolasa. ^{[ 5 ]}

Cuando el tejido vegetal se daña, el cloroplasto puede romperse y liberar catecol oxidasa en el citoplasma de la planta, y las vacuolas también pueden romperse, liberando el catecol almacenado en el citoplasma. El daño tisular también permite que el oxígeno penetre en la célula. Por lo tanto, el daño tisular facilita la interacción de la catecol oxidasa con su sustrato para producir o-benzoquinona, que puede polimerizarse de forma no enzimática para generar melaninas que forman una barrera insoluble para la protección de la herida. ^{[ 6 ]}

La catecol oxidasa está codificada en el núcleo, y su extremo N-terminal contiene un péptido señal que dirige la proteína al lumen del tilacoide del cloroplasto, donde puede ser soluble o estar débilmente asociada a la membrana del tilacoide. ^{[ 7 ]} Inicialmente transcrita como una proenzima , la precursora de la catecol oxidasa sufre dos rondas de procesamiento proteolítico y transporte antes de entrar en el lumen del tilacoide.

Utilizando una proteína precursora marcada con [ ^35S ]metionina, Sommer et al. dilucidaron una vía de procesamiento proteolítico común a diversas plantas, incluyendo el guisante ( Pisum sativum ), el tomate ( Lycopersicon esculentum ) y el maíz ( Zea mays ). ^{[ 8 ]} El precursor de 67 kD se importó al estroma de manera dependiente de ATP , donde una peptidasa estromal procesa el precursor en un intermediario de 62 kD. La translocación de este intermediario al lumen tilacoide dependía de la luz y resultaba en la generación de la enzima madura de 59 kD. ^{[ 9 ]} Basándose en el análisis de la catecol oxidasa precursora y madura purificada de Ipomoea batatas , el procesamiento proteolítico elimina tanto el péptido de tránsito N-terminal como un dominio C-terminal que cubre el sitio activo de la enzima. ^{[ 10 ]}

La estructura cristalina de la catecol oxidasa purificada de Ipomoea batatas se ha resuelto en su forma activa tanto en el estado oxidado Cu(II)-Cu(II) como en el estado reducido Cu(I)-Cu(I). ^{[ 11 ]} Es una enzima monomérica globular de un solo dominio que tiene un tamaño aproximado de 55 x 45 x 45 Å y forma elipsoidal. Un haz de cuatro hélices α constituye el núcleo de la enzima, que rodea el sitio activo que contiene el centro de dicobre. ^{[ 12 ]} Los nitrógenos en las cadenas laterales de imidazol de His 88, His109 y His118 se coordinan con el primer cobre catalítico, mientras que los nitrógenos en las cadenas laterales de imidazol en His240, His244 y His274 se coordinan con el segundo ion cobre catalítico. En el estado oxidado Cu(II)-Cu(II), cada ion de cobre posee una geometría piramidal trigonal de cuatro coordenadas, con los tres residuos de histidina y una molécula de hidróxido puente formando los cuatro ligandos en cada ion de cobre. Al comparar el estado reducido (Cu(I)-Cu(I)) con el estado nativo (Cu(II)-Cu(II)) de la enzima, la diferencia clave es la distancia entre los dos centros de cobre. En el estado oxidado Cu(II)-Cu(II), la distancia Cu-Cu es de 3,3 Å, mientras que en el estado reducido Cu(I)-Cu(I), la distancia aumenta a 4,4 Å. ^{[ 1 ]}

Si bien el sitio activo tanto de la tirosinasa como de la catecol oxidasa contiene el centro de dicobre, las variaciones en la estructura respectiva de cada enzima dan como resultado una actividad diferente. En la catecol oxidasa, una cadena lateral de fenilalanina (Phe261) se encuentra sobre uno de los centros de cobre e impide que el sustrato se coordine con ambos iones de cobre en el sitio activo. Esto impide el complejo de coordinación bidentado necesario para la hidroxilación del difenolato característica de la tirosinasa pero ausente en la catecol oxidasa. ^{[ 13 ]} Además, His109 unido a uno de los centros de cobre también está unido covalentemente a Cys192 a través de un puente tioéter . ^{[ 14 ]} Este entrecruzamiento de cisteína-histidina puede restringir aún más que el sitio activo de la enzima asuma el complejo de coordinación bidentado que se forma fácilmente en la tirosinasa.

Aunque se ha resuelto la estructura cristalina de la catecol oxidasa, persisten dudas sobre el mecanismo exacto de la reacción. Un mecanismo propuesto por Eicken et al. se basa en la estructura cristalina de la catecol oxidasa purificada de Ipomoea batatas . ^{[ 11 ]} El ciclo catalítico comienza con la catecol oxidasa en su estado nativo oxidado Cu(II)-Cu(II) con un ion hidróxido coordinado que une los dos centros de cobre. Cuando el catecol entra en el sitio activo , se abstrae un protón de uno de los alcoholes. El catecol se coordina con un centro Cu(II) de forma monodentada, desplazando uno de los residuos de histidina coordinantes. El ion hidróxido coordinado abstrae otro protón del catecol para formar agua, y el catecol se oxida a o-quinona. Los dos electrones resultantes reducen ambos centros de cobre a su estado Cu(I)-Cu(I). El dioxígeno se une a un centro de cobre, desplazando la molécula de agua coordinada, y otra molécula de catecol se une al otro centro de cobre, desplazando otro residuo de histidina. Esto forma un complejo en el que un centro de cobre tiene una coordinación tetragonal planar con His240, His244 y la molécula de dioxígeno. El otro centro de cobre conserva su geometría tetragonal piramidal inicial con el dioxígeno, His88 y His118 en posiciones ecuatoriales, y His109 en una posición axial. ^{[ 3 ]} En este estado, el sitio activo de la enzima se encuentra en un complejo ternario catecol oxidasa–O ₂ ²⁻ –catecol. Se transfieren dos electrones del sustrato al dioxígeno, seguidos de la ruptura del enlace O–O. Se libera agua y se forma el segundo producto o-quinona junto con la restauración del estado inicial Cu(II)-Cu(II) para completar el ciclo catalítico. ^{[ 15 ]}

Este ciclo catalítico propuesto está respaldado por la observación experimental de que se forman cantidades estequiométricas de o-quinona después de la adición de catecol a la enzima, incluso cuando no hay dioxígeno. ^{[ 15 ]} Además, tanto el estado oxidado Cu(II)-Cu(II) como el estado reducido Cu(I)-Cu(I) fueron los dos estados identificados por la estructura cristalina de Ipomoea batatas . La unión monodentada del catecol al centro de cobre fue respaldada por la estructura cristalina de la catecol oxidasa unida al inhibidor análogo del sustrato unido feniltiourea , que también se une al centro de cobre de forma monodentada. ^{[ 11 ]} Sin embargo, un problema con este ciclo catalítico es que la carga del sitio activo cambia durante el ciclo catalítico de +1 a +3. Esto requiere la presencia de bases cercanas que puedan almacenar los protones; sin embargo, la estructura cristalina de rayos X no indica la presencia de tales bases ya que los residuos de histidina están coordinados con los centros de cobre. ^{[ 16 ]} Se han propuesto otros ciclos catalíticos dilucidados con cálculos DFT y estructuras cristalinas que mantienen la misma carga en el sitio activo a lo largo del ciclo y, por lo tanto, no requieren bases cercanas. ^{[ 15 ] [ 16 ]} Sin embargo, ciertos intermedios en el ciclo propuesto no son consistentes con los hallazgos experimentales, como que se pueden formar cantidades estequiométricas de o-quinona después de la adición de catecol en ausencia de oxígeno. ^{[ 16 ]}

La oxidación de sustratos fenólicos a sus quinonas correspondientes es la causa principal del pardeamiento de frutas y verduras durante la maduración, manipulación y procesamiento. ^{[ 17 ]} El pardeamiento enzimático afecta la calidad nutricional y la apariencia de las frutas y productos. Se estima que más de la mitad de las pérdidas de fruta ocurren como resultado del pardeamiento enzimático, y los productos tropicales son particularmente vulnerables a esta reacción. ^{[ 6 ]} La pérdida de nutrientes puede ocurrir debido a la interacción de las quinonas, producidas por la oxidación de difenoles, con las cadenas laterales de aminoácidos esenciales derivados de proteínas vegetales. En particular, los grupos funcionales tiol y amina en las cadenas laterales de los aminoácidos son altamente susceptibles a la unión y alquilación de quinonas. ^{[ 18 ]} El papel clave de la catecol oxidasa en el pardeamiento enzimático la convierte en un objetivo común para la inhibición. Si bien existen varias estrategias de inhibición, como tratamientos a alta temperatura (70-90  °C) para eliminar la actividad catalítica de la catecol oxidasa, ^{[ 6 ]} una estrategia popular es disminuir el pH con ácido cítrico . La catecol oxidasa es más catalíticamente activa en el rango de pH 4-8 debido a la coordinación de los residuos de histidina con los centros catalíticos de cobre. El uso de ácidos como el ácido cítrico para disminuir el pH por debajo de este rango óptimo reduce la unión de la enzima a su sitio activo de cobre, ya que la protonación de los residuos de histidina interfiere con su capacidad de coordinarse con los centros de cobre. ^{[ 19 ]}

Las frutas ricas en actividad de polifenol oxidasa pueden afectar el contenido de polifenoles de otras frutas consumidas en la misma comida. En particular, los zumos y batidos de frutas mixtas presentan este riesgo, ya que las diferentes frutas (y su contenido celular) se mezclan durante un tiempo prolongado antes de que las enzimas digestivas puedan inactivar la polifenol oxidasa. Por lo tanto, estas bebidas contienen considerablemente menos polifenoles bioactivos en comparación con los zumos de frutas elaborados exclusivamente con frutas de baja actividad de PPO o con frutas enteras. ^{[ 20 ]}

Los nuevos enfoques para diseñar enzimas artificiales basadas en aminoácidos o péptidos como fragmentos moleculares característicos han propiciado una expansión significativa del campo de las enzimas artificiales o los mímicos enzimáticos. Resultados recientes del grupo de Rob Liskamp han demostrado que los residuos de histidina con andamiaje pueden utilizarse como mímicos de ciertas metaloproteínas y metaloenzimas. Se ha demostrado la imitación estructural de ciertas proteínas de cobre (por ejemplo , hemocianina , tirosinasa y catecol oxidasa), que contienen sitios de unión al cobre de tipo 3. Esto representa una mejora significativa, ya que el uso de residuos de histidina con andamiaje supone un paso más hacia la imitación de enzimas por especies biológicamente relevantes. ^{[ 21 ]}

• Catecol+Oxidasa en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.