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Análisis del ciclo celular

El análisis del ciclo celular mediante la medición del contenido de ADN es un método que emplea con mayor frecuencia la citometría de flujo para distinguir las células en difere...

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El análisis del ciclo celular mediante la medición del contenido de ADN es un método que emplea con mayor frecuencia la citometría de flujo para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular . Antes del análisis, las células se permeabilizan y se tratan con un colorante fluorescente que tiñe el ADN cuantitativamente, como el yoduro de propidio (PI) o el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La intensidad de fluorescencia de las células teñidas se correlaciona con la cantidad de ADN que contienen. Dado que el contenido de ADN se duplica durante la fase S , el contenido de ADN (y, por lo tanto, la intensidad de fluorescencia) de las células en las fases G0 y G1 ( antes de S), en la fase S, y en las fases G2 y M ( después de S) identifica la posición de la fase del ciclo celular en las fases principales (G0 / G1 frente a S frente a G2 / M) del ciclo celular. El contenido de ADN celular de las células individuales se suele representar como un histograma de frecuencia para proporcionar información sobre la frecuencia relativa (porcentaje) de células en las fases principales del ciclo celular.

Las anomalías del ciclo celular reveladas en el histograma de frecuencia del contenido de ADN se observan a menudo tras diferentes tipos de daño celular, por ejemplo, daño en el ADN que interrumpe la progresión del ciclo celular en ciertos puntos de control . Esta detención de la progresión del ciclo celular puede conducir a una reparación eficaz del ADN, que puede prevenir la transformación de una célula normal en una célula cancerosa ( carcinogénesis ), o a la muerte celular, a menudo por apoptosis . La detención de las células en G0 o G1 se observa con frecuencia como resultado de la falta de nutrientes (factores de crecimiento), por ejemplo, tras la privación de suero . El análisis del ciclo celular fue descrito por primera vez en 1969 en el Laboratorio Científico de Los Alamos por un grupo de la Universidad de California utilizando la técnica de tinción de Feulgen . [ 1 ] El primer protocolo para el análisis del ciclo celular mediante tinción con yoduro de propidio fue presentado en 1975 por Awtar Krishan de la Facultad de Medicina de Harvard y todavía se cita ampliamente en la actualidad. [ 2 ]

El análisis multiparamétrico del ciclo celular incluye, además de la medición del contenido de ADN celular, otros constituyentes/características relacionados con el ciclo celular. La medición simultánea del contenido de ADN y ARN celular, o la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización a pH bajo utilizando el colorante metacromático naranja de acridina , revela los compartimentos del ciclo celular G 1Q , G 1A y G 1B y también permite discriminar entre células S, G 2 y mitóticas. [ 3 ] Las células en G 1Q están quiescentes, retiradas temporalmente del ciclo celular (también identificables como G 0 ), las G 1A están en la fase de crecimiento mientras que las G 1B son las células justo antes de entrar en S, con su crecimiento (contenido de ARN y proteínas, tamaño) similar al de las células que inician la replicación del ADN. También se reconocen compartimentos similares del ciclo celular mediante análisis multiparamétrico que incluye la medición de la expresión de ciclina D1 , ciclina E , ciclina A y ciclina B1 , cada una en relación con el contenido de ADN [ 4 ] La medición simultánea del contenido de ADN y de la incorporación del precursor de ADN 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) mediante citometría de flujo es un ensayo especialmente útil, que se ha utilizado ampliamente en el análisis del ciclo celular in vitro e in vivo. [ 5 ] Sin embargo, la incorporación de 5-etinil-2'-deoxiuridina (EdU), el precursor cuya detección ofrece ciertas ventajas sobre BrdU, se ha convertido ahora en la metodología preferida para detectar células en replicación de ADN (fase S). [ 6 ]

Procedimiento experimental

DAPI (magenta) unido al surco menor del ADN (verde y azul). De PDB : 1D30 .

A menos que se realice la tinción con Hoechst 33342 , el primer paso para preparar las células para el análisis del ciclo celular es la permeabilización de las membranas plasmáticas . Esto generalmente se hace incubándolas en una solución tampón que contiene un detergente suave [ 7 ] como Triton X-100 o NP-40 , o fijándolas en etanol . La mayoría de los colorantes fluorescentes de ADN (una excepción es Hoechst 33342 ) no son permeables a la membrana plasmática, es decir, no pueden atravesar una membrana celular intacta. Por lo tanto, la permeabilización es crucial para el éxito del siguiente paso: la tinción de las células.

Antes (o durante) la etapa de tinción, las células suelen tratarse con RNasa A para eliminar los ARN . Esto es importante porque ciertos colorantes que tiñen el ADN también tiñen el ARN, creando así artefactos que distorsionarían los resultados. Una excepción es el fluorocromo metacromático naranja de acridina , que bajo el protocolo de tinción específico puede teñir diferencialmente tanto el ARN (generando luminiscencia roja) como el ADN (fluorescencia verde), o en otro protocolo, después de la eliminación del ARN y la desnaturalización parcial del ADN, para teñir diferencialmente el ADN de doble cadena (fluorescencia verde) frente al ADN de cadena simple (luminiscencia roja) [3] . Además del yoduro de propidio y el naranja de acridina, los colorantes cuantificables que se utilizan con frecuencia incluyen (pero no se limitan a) DRAQ5, 7-aminoactinomicina D , DAPI y Hoechst 33342 .

Discriminación de dobletes

Dado que las células, y especialmente las fijas, tienden a agruparse, los agregados celulares deben excluirse del análisis mediante un proceso denominado discriminación de dobletes . Esto es importante porque un doblete de dos células en fase G0 / G1 tiene el mismo contenido total de ADN y, por lo tanto, la misma intensidad de fluorescencia que una sola célula en fase G2 / M. [ 8 ] [ 9 ] Si no se reconocen como tales, los dobletes en fase G0 / G1 contribuirían a la identificación y el recuento de falsos positivos de células en fase G2 /M.

Ensayo de Nicoletti

El ensayo de Nicoletti , que recibe su nombre de su inventor, el médico italiano Ildo Nicoletti , es una forma modificada del análisis del ciclo celular. Se utiliza para detectar y cuantificar la apoptosis , una forma de muerte celular programada , mediante el análisis de células con un contenido de ADN inferior a 2n ("células sub-G0 / G1 " ). Estas células suelen ser el resultado de la fragmentación del ADN apoptótico : durante la apoptosis, el ADN se degrada por endonucleasas celulares . Por lo tanto, los núcleos de las células apoptóticas contienen menos ADN que los núcleos de las células sanas en fase G0 / G1 , lo que da lugar a un pico sub-G0 / G1 en el histograma de fluorescencia que puede utilizarse para determinar la cantidad relativa de células apoptóticas en una muestra. Este método fue desarrollado y descrito por primera vez en 1991 por Nicoletti y colaboradores en la Facultad de Medicina de la Universidad de Perugia . [ 10 ] Un protocolo optimizado desarrollado por dos de los autores de la publicación original se publicó en 2006. [ 11 ] Los objetos medidos dentro del pico sub-G 0 /G 1 , con un contenido de ADN menor al 5% del del pico G 0 G 1 , con toda probabilidad son cuerpos apoptóticos y, por lo tanto, no representan células apoptóticas individuales. [ 12 ]

Referencias

  1. ↑ Van Dilla MA, Trujillo TT, Mullaney PF, Coulter JR (14 de marzo de 1969). "Microfluorometría celular: un método para la medición rápida de la fluorescencia". Science . 163 (3872): 1213– 1214. Bibcode : 1969Sci...163.1213V . doi : 10.1126/science.163.3872.1213 . PMID 5812751 . S2CID 13190489 .  
  2. ↑ Krishan A. (julio de 1975). "Análisis citofluorométrico de flujo rápido del ciclo celular de mamíferos mediante tinción con yoduro de propidio" . The Journal of Cell Biology . 66 (1): 188– 193. doi : 10.1083/jcb.66.1.188 . PMC 2109516. PMID 49354 .  
  3. ↑ Darzynkiewicz Z, Traganos F, Melamed MR (1980). "Nuevos compartimentos del ciclo celular identificados mediante citometría de flujo multiparamétrica" . Cytometry . 1 (2): 98– 108. doi : 10.1002/cyto.990010203 . PMID 6170495 . 
  4. ↑ Darzynkiewicz Z, Gong JP, Juan G, Ardelt B, Traganos F (1996). "Citometría de las proteínas ciclinas" . Cytometry . 25 (1): 1– 13. doi : 10.1002/(SICI)1097-0320(19960901)25:1 < 1::AID-CYTO1 > 3.0.CO ; 2-N . PMID 8875049 . 
  5. ↑ Gray JW, Dolbeare F, Pallavicini MG, Beisker W, Waldman F (1986). "Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo". Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med . 49 (2): 237– 55. doi : 10.1080/09553008514552531 . PMID 3510993 . 
  6. ↑ Buck SB, Bradford J, Gee KR, Agnew BJ, Clarke ST, Salic A (2008). "Detección de la progresión del ciclo celular en fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina con química click, una alternativa al uso de anticuerpos de 5-bromo-2'-desoxiuridina" . BioTechniques . 44 (7): 927–9 . doi : 10.2144/000112812 . PMID 18533904 . 
  7. ↑ Vindeløv LL, Christensen IJ, Nissen NI (marzo de 1983). "Un método de tripsina con detergente para la preparación de núcleos para el análisis de ADN por citometría de flujo" . Cytometry . 3 (5): 323– 327. doi : 10.1002/cyto.990030503 . PMID 6188586 . 
  8. ↑ Sharpless T, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Melamed MR (1975). "Citofluorimetría de flujo: discriminación entre células individuales y agregados celulares mediante mediciones directas del tamaño". Acta Cytol . 19 (6): 577– 81. PMID 1108568 . 
  9. ↑ Wersto RP, Chrest FJ, Leary JF, Morris C, Stetler-Stevenson MA, Gabrielson E (15 de octubre de 2001). "Discriminación de dobletes en el análisis del ciclo celular del ADN" . Cytometry . 46 (5): 296– 306. doi : 10.1002/cyto.1171 . PMID 11746105 . 
  10. ↑ Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3 de junio de 1991). "Un método rápido y sencillo para medir la apoptosis de timocitos mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo". Journal of Immunological Methods . 139 (2): 271– 279. doi : 10.1016/0022-1759(91)90198-O . PMID 1710634 . 
  11. ↑ Riccardi C, Nicoletti I (9 de noviembre de 2006). "Análisis de la apoptosis mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo". Nature Protocols . 1 (3): 1458– 1461. doi : 10.1038/nprot.2006.238 . PMID 17406435. S2CID 4469406 .  
  12. ↑ Darzynkiewicz Z, Bedner E, Traganos F (2001). "Dificultades y escollos en el análisis de la apoptosis". Methods Cell Biol . 63 : 527–559 . doi : 10.1016/s0091-679x(01)63028-0 . PMID 11060857 . 

Lecturas adicionales

  • "Conceptos básicos del ciclo celular" (PDF) . University College London. Archivado del original (PDF, 0,1 MB) el 6 de junio de 2011. Consultado el 20 de mayo de 2010 .
  • Rabinovitch, Peter. "Introducción al análisis del ciclo celular" (PDF, 0,5 MB) . Phoenix Flow Systems, Inc. Recuperado el 20 de mayo de 2010 .
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