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Clasificación de células

La clasificación celular es el proceso mediante el cual se separa un tipo celular específico de otros presentes en una muestra, basándose en sus propiedades físicas o biológicas...

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La clasificación celular es el proceso mediante el cual se separa un tipo celular específico de otros presentes en una muestra, basándose en sus propiedades físicas o biológicas, como el tamaño, los parámetros morfológicos, la viabilidad y la expresión de proteínas tanto extracelulares como intracelulares. La población celular homogénea obtenida tras la clasificación puede utilizarse para diversas aplicaciones, como la investigación, el diagnóstico y la terapia. [ 1 ]

Métodos

Los métodos de clasificación celular se dividen en dos categorías principales: clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y clasificación celular inmunomagnética. [ 2 ] Sin embargo, gracias a años de perfeccionamiento y a la creciente demanda de separación celular, los investigadores están trabajando en el desarrollo de dispositivos de clasificación microfluídica que ofrecen numerosas ventajas en comparación con los principales métodos de clasificación celular activada por fluorescencia e inmunomagnética.

Activado por fluorescencia

Diagrama A: Clasificación celular asistida por fluorescencia para selección negativa.

La clasificación celular activada por fluorescencia también se conoce como clasificación celular por citometría de flujo o por el acrónimo FACS, que es una marca registrada de Becton Dickinson and Company . La clasificación celular activada por fluorescencia utiliza la citometría de flujo para separar células en función de parámetros morfológicos y la expresión de múltiples proteínas extracelulares e intracelulares. Este método permite la clasificación celular multiparamétrica e implica la encapsulación de células en pequeñas gotas líquidas a las que se les aplican cargas eléctricas selectivas y se clasifican mediante un campo eléctrico externo . La clasificación celular activada por fluorescencia cuenta con varios sistemas que trabajan conjuntamente para lograr una clasificación exitosa de los eventos de interés. Estos incluyen sistemas fluidos, ópticos y electrostáticos. El sistema fluido debe establecer una separación precisa y temporizada del flujo de líquido en pequeñas gotas uniformes, de modo que las gotas que contienen células individuales puedan desviarse electrostáticamente [ 2 ]. Basándose en la invención de Richard Sweet, [ 3 ] la formación de gotas del chorro de líquido de un clasificador celular se estabiliza mediante vibraciones de un transductor ultrasónico en la salida del orificio de la boquilla. Las perturbaciones crecen exponencialmente y provocan la fragmentación del chorro en gotitas con una sincronización precisa. Una célula de interés que debe clasificarse se mide en la zona de detección y se desplaza por el chorro hasta el punto de ruptura. Durante la separación de la gotita con la célula del chorro de líquido intacto, se aplica un pulso de voltaje al chorro de líquido para que las gotitas que contienen las células de interés se desvíen en un campo eléctrico entre dos placas deflectoras para su clasificación. Las gotitas se recogen mediante tubos o recipientes colocados debajo de las placas deflectoras. [ 2 ] La clasificación celular por citometría de flujo ofrece una especificidad muy alta según uno o varios marcadores de superficie, pero una limitación reside en el número de células que se pueden procesar durante una jornada laboral. Por este motivo, a menudo se considera el preenriquecimiento de la población de interés mediante clasificación celular inmunomagnética, especialmente cuando las células objetivo son relativamente escasas y se debe procesar un gran lote de células. Además, los clasificadores celulares por citometría de flujo son instrumentos complejos que generalmente solo utilizan personal altamente capacitado en instalaciones de citometría de flujo o laboratorios bien equipados y, dado su gran tamaño, no siempre es posible colocarlos dentro de una cabina de seguridad biológica.Por lo tanto, no siempre es posible garantizar la esterilidad de las muestras y, dado que los sistemas de fluidos se pueden limpiar pero no son de un solo uso, existe la posibilidad de contaminación cruzada entre muestras. Otro aspecto a considerar es que la generación de gotas dentro del instrumento podría generar aerosoles peligrosos para el operador al manipular muestras infecciosas. Estas últimas consideraciones son de particular importancia cuando la clasificación celular se utiliza para aplicaciones clínicas, por ejemplo, la terapia celular, y debe realizarse bajo condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF). Los investigadores pueden utilizar diversos colorantes fluorescentes para diseñar paneles multicolores que permitan una clasificación simultánea y exitosa de múltiples tipos celulares definidos con precisión. El diagrama A muestra la clasificación celular activada por fluorescencia de selección negativa (grupo no deseado) y el diagrama B muestra la FACS de selección positiva (grupo deseado).

Diagrama B: Clasificación celular asistida por fluorescencia para selección positiva.

Colorantes fluorescentes en la clasificación celular

Los colorantes fluorescentes pueden actuar de maneras muy diferentes. Generalmente, un colorante fluorescente se excita mediante una fuente de luz (un láser) a una longitud de onda específica y emite luz con menor energía y mayor longitud de onda. Los colorantes más comunes actúan uniéndose a antígenos presentes en las células. Los antígenos más comunes a los que se dirigen son los cúmulos de diferenciación (CD). [ 4 ] Estos son específicos de un tipo determinado de célula. Si se puede identificar qué CD está presente en las células de interés, se puede teñir la muestra con un colorante fluorescente específico para él y utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia para separar la población de interés. Sin embargo, existen muchos otros mecanismos mediante los cuales los colorantes fluorescentes pueden actuar.

Algunos colorantes pueden difundirse a través de las membranas. Aprovechando esta propiedad, se puede caracterizar la actividad intracelular y la expresión superficial de proteínas. Por ejemplo, en células muertas, el yoduro de propidio (PI) puede penetrar en el núcleo, donde se une al ADN. La señal fluorescente del PI se puede utilizar para cuantificar el contenido de ADN en el análisis del ciclo celular o para identificar células muertas en una muestra.

Ciertos colorantes fluorescentes pueden utilizarse para caracterizar la actividad intracelular cinética en lugar de fijar las células con formaldehído y perder células viables. La tabla siguiente describe los colorantes que pueden utilizarse para medir diversos parámetros de citotoxicidad causados ​​por el estrés oxidativo .

Esta configuración experimental es solo un ejemplo de las capacidades de la citometría de flujo. En los sistemas FACS, estas células caracterizadas pueden clasificarse y purificarse para experimentos posteriores.

Clasificación inmunomagnética de células

MACS

La clasificación celular inmunomagnética, también conocida como separación celular inmunomagnética, enriquecimiento celular inmunomagnético o clasificación celular activada magnéticamente , se conoce comúnmente por el acrónimo MACS, marca registrada de Miltenyi GmbH . Esta técnica se basa en la separación de microesferas mediante un campo magnético. Diversas empresas ofrecen diferentes soluciones para el enriquecimiento o la depleción de poblaciones celulares. La clasificación celular inmunomagnética proporciona un método para enriquecer una mezcla heterogénea de células en función de la expresión de proteínas de superficie celular (antígenos). Esta tecnología se basa en la unión de pequeñas partículas supramagnéticas inertes a anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para los antígenos de la población celular objetivo. Las células marcadas con estos conjugados anticuerpo-microesfera se separan mediante una columna que contiene una matriz ferromagnética. Al aplicar un campo magnético a la matriz, las microesferas se adhieren a ella dentro de la columna, impidiendo que las células que las contienen la atraviesen. Las células no marcadas pueden atravesar la matriz y se recogen en el flujo de salida. Para eluir las células atrapadas de la columna, simplemente se retira el campo magnético. Por lo tanto, la clasificación celular inmunomagnética permite diferentes estrategias para el enriquecimiento o la depleción de células. [ 2 ] Las microesferas inmunomagnéticas son pequeñas y generalmente no interfieren con los ensayos posteriores; sin embargo, para algunas aplicaciones puede ser necesario retirarlas. El uso de este método de separación permite aumentar el número de células sin incrementar significativamente los tiempos de procesamiento, y la esterilidad de la muestra está garantizada si la clasificación celular se realiza dentro de una cabina de bioseguridad. Por otro lado, esta técnica permite separar las células basándose únicamente en un marcador y no puede discriminar entre diferentes niveles de expresión de proteínas (análisis cuantitativo). La clasificación celular inmunomagnética ha demostrado ser beneficiosa en particular con cultivos de células progenitoras neurales (CPN ), ya que es más fácil de manejar y causa un daño mínimo a las células vivas. [ 5 ]

Los cultivos de NPC son especialmente difíciles de manejar porque las células cerebrales vivas son sensibles y tienden a contaminarse entre sí. [ 5 ] Para obtener resultados más claros, los laboratorios necesitan materiales más limpios, es decir, líneas de NPC más puras. [ 5 ] Un estudio realizado en 2019 (con el apoyo financiero de la New York Stem Cell Foundation y la Association for Frontotemporal Degeneration) encontró que la clasificación celular inmunomagnética es una forma económica y sencilla de obtener dicha pureza con un daño mínimo a las líneas celulares, manteniendo así células de mejor calidad, recolectando NPC más homogéneas y aumentando sus posibilidades de encontrar tratamientos efectivos para trastornos neurológicos. [ 5 ] Utilizaron tanto el método inmunomagnético como el activado por fluorescencia para filtrar CD271 - (marcadores útiles para células madre mesenquimales ) y CD133 + (marcadores para células madre cancerosas) para comparar la viabilidad de cada método. [ 5 ]

La clasificación inmunomagnética de células también se ha utilizado en la reproducción asistida (inseminación artificial) y en el tratamiento de trasplante de retina. [ 6 ] [ 7 ] En el caso de la reproducción asistida, se separan los espermatozoides apoptóticos (células muertas o dañadas) para poder recolectar más espermatozoides no apoptóticos (no fragmentados) y utilizarlos para aumentar las probabilidades de fertilidad del sujeto. [ 6 ] Este tipo de tratamiento ha demostrado ser más eficaz cuando se realiza repetidamente, aumentando la cantidad de células no apoptóticas presentes durante la inseminación. [ 6 ]

Un estudio realizado en Francia en 2018 (con el apoyo de varias personas y agencias, incluyendo el Institut de la Vision en París y la Retina France Association) utilizó ratas y el método de clasificación celular inmunomagnética para demostrar que los fotorreceptores (células en la retina que responden a la luz) pueden trasplantarse para curar la ceguera. [ 7 ] En este proceso, las microesferas se unieron a la enzima CD73 para ayudar en la separación de los PR (fotorreceptores) de los organoides retinianos. [ 7 ] Cuando un antígeno CD73+ se expresó con células RCVRN+ (proteínas de unión al calcio en el ojo), mostró a los investigadores que esta combinación de CD73+ y RCVRN+ podría usarse con precursores de PR postmitóticos para la reparación. [ 7 ] Aunque el estudio no pudo verificar el éxito en humanos, tiene la base para futuras investigaciones basadas en el éxito del emparejamiento de fotorreceptores no dañados con un antígeno CD73 y el trasplante en ratas. [ 7 ] Este éxito en la separación y el emparejamiento de células mediante trasplante muestra potencial para una posible cura de enfermedades de la retina, incluida la ceguera total. Hasta el momento, solo se ha informado de una recuperación parcial de la visión. [ 7 ]

Dispositivos microfluídicos

Debido a las limitaciones de los dispositivos de clasificación celular activados por fluorescencia e inmunomagnéticos, ha surgido una amplia gama de dispositivos microfluídicos de clasificación celular. Algunos de ellos ya están disponibles comercialmente o en fase de desarrollo. La investigación sobre el diseño de clasificadores celulares microfluídicos suele emplear técnicas de litografía blanda que utilizan materiales como el polidimetilsiloxano (PDMS).

Una ventaja clave de los clasificadores microfluídicos es la posibilidad de realizar la clasificación celular activada por fluorescencia en un cartucho estéril cerrado de un solo uso. Dicho cartucho cerrado evitaría la exposición del operador a riesgos biológicos a través de las gotas emitidas por los sistemas FACS. Otras ventajas incluyen un menor impacto en la viabilidad celular debido a la reducción del estrés hidrodinámico sobre las células. Algunos dispositivos publicados muestran el potencial para la clasificación multidireccional, un menor coste del cartucho gracias a métodos de fabricación de bajo coste, un menor consumo de energía y un tamaño reducido, llegando algunos dispositivos al tamaño de una tarjeta de crédito. Algunos han alcanzado resultados de alta pureza y tasas de hasta aproximadamente 50 000 células/s. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

Los clasificadores celulares microfluídicos se dividen en dos categorías: activos y pasivos. Los dispositivos activos desvían las células individualmente mediante mediciones citométricas realizadas en tiempo real. Los dispositivos pasivos aprovechan las diferencias físicas entre las células en su interacción con el flujo de fluido o las superficies.

Activo

Los separadores celulares microfluídicos activos implican la desviación de células individuales tras su medición mediante métodos citométricos, que incluyen el marcaje fluorescente, la dispersión de la luz y el análisis de imágenes. Las células individuales se desvían mediante una fuerza aplicada directamente sobre ellas o sobre el fluido que las rodea, de modo que fluyen hacia recipientes de salida separados.

Los métodos de desviación celular emplean varios tipos de actuadores macroscópicos, ópticos o MEMS (sistemas microelectromecánicos) para desviar una partícula o un volumen de líquido dentro de un microcanal. Ejemplos recientes notables se basan en actuadores de ondas acústicas superficiales , [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] actuadores macroscópicos (como actuadores piezoeléctricos) acoplados a microcanales, [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] dielectroforesis de gotas, [ 22 ] actuadores de burbujas de vapor térmico, [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] microvórtices transitorios generados por actuadores de burbujas de vapor térmico, [ 28 ] manipulación óptica, [ 29 ] y válvulas micromecánicas. Los más rápidos de estos han demostrado tasas de clasificación superiores a 1000/s y tasas de procesamiento máximas potenciales que en algunos casos se aproximan a las de FACS. [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] La clasificación celular microfluídica activa requiere una instrumentación de citometría similar a la descrita anteriormente para la clasificación celular activada por fluorescencia. [ 36 ]

Los clasificadores celulares microfluídicos activos tienen el potencial de escalar el rendimiento mediante la paralelización en el chip. [ 37 ] El dispositivo de clasificación microfluídica activa más rápido publicado ha demostrado un rendimiento de 160 000/s [ 38 ]

Pasivo

La clasificación celular pasiva utiliza el comportamiento del fluido dentro de los microcanales para alterar y separar las células según su tamaño y morfología. [ 39 ] El fluido en una solución coloidal está sujeto a un perfil de velocidad debido a las interacciones del fluido con las paredes del canal; las células en la solución están sujetas a diversas fuerzas de arrastre e inerciales que dependen del tamaño de la célula y se equilibran en consecuencia en diferentes ubicaciones a lo largo del perfil de velocidad. [ 40 ] En canales microfluídicos curvos, se forman vórtices debido a la fuerza de Dean que ubican partículas de diferentes tamaños en diferentes ubicaciones de la sección transversal debido al número de Reynolds y al radio de curvatura de la curva. [ 41 ]

Por ejemplo, en un canal recto, las células más grandes en solución coloidal se encuentran más cerca del centro del microcanal que las células más pequeñas debido a las mayores fuerzas de arrastre de la pared que empujan la célula lejos de la pared y a la fuerza de gradiente de cizallamiento del perfil de velocidad que equilibra esta fuerza de arrastre de la pared para poner la célula en equilibrio. [ 42 ]

Otros métodos de separación celular basados ​​en anticuerpos

Se emplearon varios métodos de separación y enriquecimiento celular mediante anticuerpos antes de que la clasificación celular basada en fluorescencia e inmunomagnética ganara popularidad. [ 43 ] Estos incluían la separación celular mediada por anticuerpos y complemento, dispositivos de inmunoafinidad de poliestireno y el sistema CellPro CEPRATE® SC, que empleaba anticuerpos inmovilizados en una columna porosa. Este último fue el primer dispositivo médico aprobado por la FDA para la separación de células madre hematopoyéticas .

Una técnica más reciente de separación celular que emplea anticuerpos es la clasificación celular activada por flotabilidad (BACS). Esta técnica consiste en la unión de microburbujas a las células mediante anticuerpos que se unen a la superficie celular. Posteriormente, las células objetivo se eliminan de la muestra biológica mediante flotación. [ 44 ]

Clasificación de células individuales

La clasificación de células individuales proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células en función de sus propiedades intracelulares y extracelulares. Los métodos de célula individual permiten comprender propiedades celulares que podrían estar ocultas o no ser evidentes. Existen varios métodos para clasificar células individuales:

La matriz de microbalsas proporciona un método rápido y rentable para aislar células, analizarlas a lo largo del tiempo y generar poblaciones clonales con la capacidad única de monitorizar todas las propiedades intra y extracelulares. [ 45 ] Este sistema es ideal tanto para tipos de células adherentes como no adherentes.

Se estudió un método de célula única para observar la respuesta a un estímulo externo (en este caso, la respuesta celular a un ligando) utilizando un dispositivo microfluídico con válvulas de microcanales para atrapar una sola célula en una cámara. Se empleó un sistema de 23 válvulas para la actuación y un colorante fluorescente para la obtención de imágenes de estímulo-respuesta. [ 46 ]

Los métodos de agrupamiento de células individuales son una serie de métodos estadísticos diseñados por científicos de datos basados ​​en propiedades intracelulares. El proceso incluye la recopilación de datos de RNA-Seq de células individuales; el preprocesamiento de datos para el agrupamiento; el agrupamiento; y las evaluaciones del agrupamiento. Los científicos aplican métodos de aprendizaje automático (principalmente análisis de agrupamiento) a los datos de RNA-Seq de células individuales para dividir las células en diferentes categorías. Todos los métodos se modifican para resolver problemas en los datos de RNA-Seq, como la pérdida de genes de baja expresión y marcadores celulares ambiguos en presencia de sesgos técnicos. Los métodos de vanguardia incluyen SC3, [ 47 ] CIDR, [ 48 ] Seurat y para obtener información más detallada, consulte la página Wiki: Agrupamiento de RNA-Seq de células individuales.

Referencias

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