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Imágenes químicas

La imagen química (como mapeo químico cuantitativo ) es la capacidad analítica para crear una imagen visual de la distribución de componentes a partir de la medición simultánea ...

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La imagen química (como mapeo químico cuantitativo ) es la capacidad analítica para crear una imagen visual de la distribución de componentes a partir de la medición simultánea de espectros e información espacial y temporal. [ 1 ] [ 2 ] La imagen hiperespectral mide bandas espectrales contiguas, a diferencia de la imagen multiespectral que mide bandas espectrales espaciadas. [ 3 ]

La idea principal, para la obtención de imágenes químicas, es que el analista puede optar por tomar tantos espectros de datos como sea posible medidos en un componente químico específico en una ubicación espacial y en un momento dado; esto resulta útil para la identificación y cuantificación química. Alternativamente, seleccionar un plano de imagen en un espectro de datos específico ( PCA : datos multivariables de longitud de onda, ubicación espacial y tiempo) permite mapear la distribución espacial de los componentes de la muestra, siempre que sus firmas espectrales sean diferentes en el espectro de datos seleccionado.

El software para imágenes químicas es muy específico y se distingue de los métodos químicos como la quimiometría .

La instrumentación de imagen tiene tres componentes: una fuente de radiación para iluminar la muestra, un elemento selectivo espectralmente y, generalmente, un conjunto de detectores (la cámara) para capturar las imágenes. El formato de datos se denomina hipercubo . El conjunto de datos puede visualizarse como un cubo de datos , un bloque tridimensional que abarca dos dimensiones espaciales (x e y), con una serie de longitudes de onda (lambda) que conforman el tercer eje (espectral). El hipercubo puede tratarse visual y matemáticamente como una serie de imágenes con resolución espectral (cada plano de imagen corresponde a la imagen en una longitud de onda) o como una serie de espectros con resolución espacial.

Historia

Los sistemas de imagen química de laboratorio disponibles comercialmente surgieron a principios de la década de 1990 (refs. 1-5). Además de factores económicos, como la necesidad de componentes electrónicos sofisticados y ordenadores de altísima gama, una barrera importante para la comercialización de la imagen infrarroja fue que el conjunto de plano focal (FPA) necesario para leer imágenes infrarrojas no estaba fácilmente disponible en el mercado. A medida que la electrónica de alta velocidad y los ordenadores sofisticados se hicieron más comunes, y las cámaras infrarrojas se volvieron fácilmente accesibles comercialmente, se introdujeron los sistemas de imagen química de laboratorio.

Inicialmente utilizada para la investigación novedosa en laboratorios especializados, la imagen química se convirtió en una técnica analítica más común para I+D general, aseguramiento de la calidad (AC) y control de calidad (CC) en menos de una década. La rápida aceptación de esta tecnología en diversas industrias (farmacéutica, polímeros, semiconductores, seguridad, forense y agricultura) radica en la gran cantidad de información que proporciona para caracterizar tanto la composición química como la morfología. La naturaleza paralela de los datos de imagen química permite analizar múltiples muestras simultáneamente para aplicaciones que requieren un análisis de alto rendimiento, además de la caracterización de una sola muestra.

Aplicaciones

La imagen hiperespectral se aplica con mayor frecuencia a muestras sólidas o en gel, y tiene aplicaciones en química, biología, [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] medicina, [ 10 ] [ 11 ] farmacia [ 12 ] [ 13 ] (véase también, por ejemplo: ciencia de los alimentos, biotecnología, [ 14 ] [ 15 ] agricultura e industria. La imagen química NIR, IR y Raman también se denomina imagen hiperespectral , espectroscópica, espectral o multiespectral (véase también microespectroscopia ). Sin embargo, también se utilizan otras técnicas de imagen ultrasensibles y selectivas que implican microespectroscopia UV-visible o de fluorescencia. Muchas técnicas de imagen se pueden utilizar para analizar muestras de todos los tamaños, desde la molécula individual [ 16 ] [ 17 ] hasta el nivel celular en biología y medicina, [ 10 ] [ 18 ] [ 19 ] y a imágenes de sistemas planetarios en astronomía, pero con diferente instrumentación Se emplea para realizar observaciones en sistemas tan diversos.

Cualquier material cuya funcionalidad dependa de gradientes químicos puede estudiarse mediante una técnica analítica que combine la caracterización espacial y química. Para diseñar y fabricar estos materiales de forma eficiente y eficaz, es necesario medir tanto el "qué" como el "dónde". La demanda de este tipo de análisis aumenta a medida que los materiales manufacturados se vuelven más complejos. Las técnicas de imagen química son fundamentales para comprender los productos manufacturados modernos y, en algunos casos, constituyen una técnica no destructiva que permite conservar las muestras para análisis posteriores.

Muchos materiales, tanto manufacturados como naturales, derivan su funcionalidad de la distribución espacial de sus componentes. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas de liberación prolongada se logran mediante un recubrimiento que actúa como barrera. La liberación del principio activo se controla mediante esta barrera, y las imperfecciones en el recubrimiento, como las discontinuidades, pueden alterar su eficacia. En la industria de los semiconductores, las irregularidades o los contaminantes en las obleas de silicio o los microcircuitos impresos pueden provocar fallos en estos componentes. La funcionalidad de los sistemas biológicos también depende de gradientes químicos: una sola célula, un tejido e incluso órganos enteros funcionan gracias a la disposición específica de sus componentes. Se ha demostrado que incluso pequeños cambios en la composición y distribución química pueden ser un indicador temprano de enfermedad.

Principios

La imagen química comparte los fundamentos de las técnicas de espectroscopia vibracional, pero proporciona información adicional mediante la adquisición simultánea de espectros con resolución espacial. Combina las ventajas de la imagen digital con las características de las mediciones espectroscópicas. En resumen, la espectroscopia vibracional mide la interacción de la luz con la materia. Los fotones que interactúan con una muestra se absorben o se dispersan; se absorben fotones de energía específica, y el patrón de absorción proporciona información, o una huella dactilar, sobre las moléculas presentes en la muestra.

Por otro lado, en cuanto a la configuración de observación, la obtención de imágenes químicas puede realizarse mediante uno de los siguientes modos: absorción (óptica) , emisión (fluorescencia), transmisión (óptica) o dispersión (Raman). Existe consenso en que los modos de fluorescencia ( emisión ) y dispersión Raman son los más sensibles y potentes, pero también los más costosos.

En una medición de transmisión, la radiación atraviesa una muestra y es medida por un detector ubicado en el lado opuesto de la misma. La energía transferida de la radiación incidente a la(s) molécula(s) se puede calcular como la diferencia entre la cantidad de fotones emitidos por la fuente y la cantidad medida por el detector. En una medición de reflectancia difusa, se realiza la misma medición de diferencia de energía, pero la fuente y el detector se encuentran en el mismo lado de la muestra, y los fotones medidos han reemergido del lado iluminado de la muestra en lugar de atravesarla. La energía se puede medir en una o varias longitudes de onda; cuando se realiza una serie de mediciones, la curva de respuesta se denomina espectro .

Un elemento clave en la adquisición de espectros es la selección energética de la radiación, ya sea antes o después de interactuar con la muestra. Esta selección puede realizarse mediante un filtro fijo, un filtro sintonizable, un espectrógrafo, un interferómetro u otros dispositivos. Con un filtro fijo, no es eficiente recopilar un número significativo de longitudes de onda, por lo que generalmente se obtienen datos multiespectrales. La imagen química basada en interferómetros requiere la recopilación de rangos espectrales completos, lo que da como resultado datos hiperespectrales . Los filtros sintonizables ofrecen la flexibilidad de proporcionar datos multiespectrales o hiperespectrales , según los requisitos analíticos.

Los espectros se miden normalmente con un espectrómetro de imágenes , basado en una matriz de plano focal .

Terminología

Algunos términos comunes en espectroscopia, microscopía óptica y fotografía se han adaptado o modificado para su uso en imagen química. Entre ellos se incluyen: resolución, campo de visión y aumento. Existen dos tipos de resolución en imagen química. La resolución espectral se refiere a la capacidad de distinguir pequeñas diferencias de energía; se aplica al eje espectral. La resolución espacial es la distancia mínima entre dos objetos necesaria para que se detecten como objetos distintos. La resolución espacial está influenciada por el campo de visión , una medida física del tamaño del área analizada. En imagen, el campo de visión es el producto del aumento y el número de píxeles en la matriz del detector. El aumento es la relación entre el área física de la matriz del detector y el área del campo de visión de la muestra. Mayores aumentos para el mismo detector capturan un área menor de la muestra.

Tipos de instrumentos de imagen química vibracional

La obtención de imágenes químicas se ha implementado para la espectroscopia de infrarrojo medio, infrarrojo cercano y espectroscopia Raman . Al igual que con sus contrapartes de espectroscopia de volumen, cada técnica de imagen tiene fortalezas y debilidades particulares, y se adapta mejor a diferentes necesidades.

Imágenes químicas en el infrarrojo medio

Un conjunto de piedras escaneadas con un generador de imágenes hiperespectrales Specim LWIR-C en el rango infrarrojo térmico de 7,7 μm a 12,4 μm. Los espectros de minerales como el cuarzo y el feldespato son claramente reconocibles. [ 20 ]

La espectroscopia de infrarrojo medio (MIR) analiza las vibraciones moleculares fundamentales, que se producen en el rango espectral de 2500 a 25 000  nm. Las implementaciones comerciales de imágenes en la región MIR emplean generadores de imágenes hiperespectrales o interferómetros de infrarrojo por transformada de Fourier ( FT-IR ), según la aplicación. Las bandas de absorción MIR tienden a ser relativamente estrechas y bien resueltas; un espectroscopista experimentado suele poder realizar una interpretación espectral directa. La espectroscopia MIR permite distinguir cambios sutiles en la química y la estructura, y se utiliza a menudo para la identificación de materiales desconocidos. Las absorciones en este rango espectral son relativamente fuertes; por ello, es importante la presentación de la muestra para limitar la cantidad de material que interactúa con la radiación incidente en la región MIR. Los datos se pueden recopilar en modo de reflectancia, transmisión o emisión. El agua absorbe fuertemente la radiación MIR, y las muestras húmedas suelen requerir procedimientos de muestreo avanzados (como la reflectancia total atenuada ). Los instrumentos comerciales incluyen mapeo de puntos y líneas, e imágenes. También es posible realizar imágenes químicas en el infrarrojo medio con resolución espacial a nivel nanométrico mediante espectroscopia infrarroja basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-IR). La obtención de imágenes hiperespectrales de todo el ancho de banda del infrarrojo medio se puede lograr en segundos utilizando pulsos ultracortos de infrarrojo medio. [ 21 ]

Imágenes químicas remotas de una liberación simultánea de SF 6 y NH 3 a 1,5 km utilizando el espectrómetro de imágenes Telops Hyper-Cam [ 22 ].

Para conocer los tipos de microscopios MIR, consulte Microscopía#Microscopía infrarroja .

También se utilizan ventanas atmosféricas en el espectro infrarrojo para realizar imágenes químicas a distancia. En estas regiones espectrales, los gases atmosféricos (principalmente agua y CO₂ ) presentan baja absorción y permiten la visualización infrarroja a distancias de kilómetros. Las moléculas objetivo pueden observarse mediante los procesos de absorción/emisión selectiva descritos anteriormente. En la imagen se muestra un ejemplo de la obtención de imágenes químicas de una liberación simultánea de SF₆ y NH₃ .

Imágenes químicas en el infrarrojo cercano

La región analítica del infrarrojo cercano (NIR) abarca el rango de 780  nm a 2500  nm. Las bandas de absorción observadas en este rango espectral se deben a sobretonos y bandas de combinación de vibraciones de estiramiento y flexión de OH, NH, CH y SH. La absorción es de uno a dos órdenes de magnitud menor en el NIR en comparación con el infrarrojo medio (MIR); este fenómeno elimina la necesidad de una preparación exhaustiva de la muestra. Se pueden analizar muestras gruesas y delgadas sin ninguna preparación previa, es posible obtener imágenes químicas NIR a través de algunos materiales de embalaje y la técnica puede utilizarse para examinar muestras hidratadas, dentro de ciertos límites. Las muestras intactas pueden visualizarse mediante transmitancia o reflectancia difusa.

Las formas de línea para las bandas de sobretono y combinación tienden a ser mucho más anchas y superpuestas que para las bandas fundamentales vistas en el MIR. A menudo, se utilizan métodos multivariados para separar las firmas espectrales de los componentes de la muestra. La imagen química NIR es particularmente útil para realizar análisis rápidos, reproducibles y no destructivos de materiales conocidos. [ 23 ] [ 24 ] Los instrumentos de imagen NIR se basan típicamente en una cámara hiperespectral , un filtro sintonizable o un interferómetro FT-IR. Siempre se necesita una fuente de luz externa, como el sol (escaneos en exteriores, teledetección) o una lámpara halógena (laboratorio, mediciones industriales).

Imágenes químicas Raman

El rango espectral de la imagen química por desplazamiento Raman abarca desde aproximadamente 50 hasta 4000 cm⁻¹  ; el rango espectral real sobre el que se realiza una medición Raman particular es función de la frecuencia de excitación del láser. El principio básico de la espectroscopia Raman difiere del MIR y el NIR en que el eje x del espectro Raman se mide como una función del desplazamiento de energía (en cm⁻¹ ) relativo a la frecuencia del láser utilizado como fuente de radiación. En resumen, el espectro Raman surge de la dispersión inelástica de fotones incidentes, que requiere un cambio en la polarizabilidad con la vibración, a diferencia de la absorción infrarroja, que requiere un cambio en el momento dipolar con la vibración. El resultado final es información espectral similar y, en muchos casos, complementaria a la del MIR. El efecto Raman es débil: solo alrededor de uno de cada 10⁷ fotones incidentes en la muestra experimenta dispersión Raman. Tanto los materiales orgánicos como los inorgánicos poseen un espectro Raman; generalmente producen bandas nítidas que son químicamente específicas. La fluorescencia es un fenómeno competitivo y, dependiendo de la muestra, puede enmascarar la señal Raman, tanto en espectroscopia volumétrica como en técnicas de imagen.

La espectroscopia Raman de imagen química requiere poca o ninguna preparación de la muestra. Sin embargo, se puede utilizar el seccionamiento físico de la muestra para exponer la superficie de interés, procurando obtener una superficie lo más plana posible. Las condiciones requeridas para una medición específica determinan el grado de invasividad de la técnica, y las muestras sensibles a la radiación láser de alta potencia pueden dañarse durante el análisis. Es relativamente insensible a la presencia de agua en la muestra y, por lo tanto, resulta útil para obtener imágenes de muestras que contienen agua, como material biológico.

Imágenes de fluorescencia (regiones ultravioleta, visible e infrarroja cercana)

La microespectroscopia de emisión es una técnica sensible con excitación y emisión que abarca las regiones ultravioleta, visible e infrarroja cercana (NIR). Por ello, cuenta con numerosas aplicaciones biomédicas, biotecnológicas y agrícolas. Existen varias técnicas de fluorescencia potentes, altamente específicas y sensibles que se utilizan actualmente o que aún se encuentran en desarrollo; entre las primeras se incluyen FLIM, FRAP, FRET y FLIM-FRET; entre las segundas se encuentran la fluorescencia NIR y las técnicas de microespectroscopia y nanoespectroscopia de fluorescencia NIR con sensibilidad de sonda mejorada (véase la sección "Lecturas adicionales"). La microespectroscopia y la imagen de emisión de fluorescencia también se utilizan comúnmente para localizar cristales de proteínas [ 25 ] en solución, para la caracterización de metamateriales y dispositivos biotecnológicos.

Muestreo y muestras

El valor de la microscopía reside en la capacidad de resolver heterogeneidades espaciales en muestras sólidas o en gel/similares a gel. La obtención de imágenes de un líquido o incluso una suspensión tiene una utilidad limitada, ya que el movimiento constante de la muestra sirve para promediar la información espacial, a menos que se empleen técnicas de registro ultrarrápidas, como en la microespectroscopia de correlación de fluorescencia o las observaciones FLIM, donde se puede monitorizar una sola molécula a una velocidad de detección (fotométrica) extremadamente alta. Sin embargo, los experimentos de alto rendimiento (como la obtención de imágenes de placas de múltiples pocillos) de muestras líquidas pueden proporcionar información valiosa. En este caso, la adquisición paralela de miles de espectros se puede utilizar para comparar diferencias entre muestras, en lugar de la implementación más común de explorar la heterogeneidad espacial dentro de una sola muestra.

De manera similar, no hay beneficio en obtener imágenes de una muestra verdaderamente homogénea, ya que un espectrómetro de un solo punto generará la misma información espectral. Por supuesto, la definición de homogeneidad depende de la resolución espacial del sistema de imagen empleado. Para la imagen MIR, donde las longitudes de onda abarcan de 3 a 10 micrómetros, teóricamente se pueden resolver objetos del orden de 5 micrómetros. Las áreas muestreadas están limitadas por las implementaciones experimentales actuales porque la iluminación la proporciona el interferómetro. La imagen Raman puede resolver partículas de menos de 1 micrómetro de tamaño, pero el área de muestra que se puede iluminar está severamente limitada. Con la imagen Raman, se considera poco práctico obtener imágenes de grandes áreas y, por consiguiente, de grandes muestras. La imagen química/hiperespectral FT-NIR generalmente solo resuelve objetos más grandes (>10 micrómetros) y es más adecuada para muestras grandes porque las fuentes de iluminación están fácilmente disponibles. Sin embargo, recientemente se informó que la microespectroscopia FT-NIR es capaz de alcanzar una resolución de aproximadamente 1,2 micras (micrómetros) en muestras biológicas [ 10 ]. Además, se informó que los experimentos de FCS de excitación de dos fotones alcanzaron una resolución de 15 nanómetros en películas delgadas de biomembranas con una configuración especial de conteo de fotones de coincidencia.

Límite de detección

El concepto de límite de detección en la imagen química difiere considerablemente del de la espectroscopia global, ya que depende de la muestra misma. Dado que un espectro global representa un promedio de los materiales presentes, las firmas espectrales de los componentes traza se ven enmascaradas por la dilución. En cambio, en la imagen, cada píxel tiene un espectro correspondiente. Si el tamaño físico del contaminante traza es del orden del tamaño del píxel capturado en la muestra, es probable que su firma espectral sea detectable. Sin embargo, si el componente traza se encuentra disperso de forma homogénea (en relación con el tamaño del píxel) en toda la muestra, no será detectable. Por lo tanto, los límites de detección de las técnicas de imagen química están fuertemente influenciados por el tamaño de las partículas, la heterogeneidad química y espacial de la muestra y la resolución espacial de la imagen.

Análisis de datos

Los métodos de análisis de datos para conjuntos de datos de imágenes químicas suelen emplear algoritmos matemáticos comunes a la espectroscopia de punto único o al análisis de imágenes. Esto se debe a que el espectro adquirido por cada detector equivale a un espectro de punto único; por lo tanto, se utilizan técnicas de preprocesamiento, quimiometría y reconocimiento de patrones con el objetivo común de separar los efectos químicos y físicos y realizar una caracterización cualitativa o cuantitativa de los componentes individuales de la muestra. En la dimensión espacial, cada imagen química equivale a una imagen digital, y se pueden utilizar análisis de imágenes estándar y análisis estadísticos robustos para la extracción de características.

Software

  • Software de aprendizaje de objetos FECOM (OLS), procesamiento industrial de características hiperespectrales en línea [ 26 ]
  • UmBio Evince Image, análisis de imágenes hiperespectrales multivariadas
  • Sistema de percepción; imágenes hiperespectrales en línea para la industria [ 27 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • FLIM | Microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia: fluorescencia, imágenes químicas de fluoróforos, microespectroscopia de emisión confocal, FRET, microespectroscopia de fluorescencia de correlación cruzada .
  • Aplicaciones de FLIM: "FLIM permite discriminar entre la fluorescencia que emana de diferentes fluoróforos y moléculas autofluorescentes en una muestra, incluso si sus espectros de emisión son similares. Por lo tanto, es ideal para identificar fluoróforos en estudios de marcaje múltiple. FLIM también se puede utilizar para medir concentraciones iónicas intracelulares sin procedimientos de calibración extensos (por ejemplo, verde de calcio) y para obtener información sobre el entorno local de un fluoróforo a partir de los cambios en su tiempo de vida." FLIM también se utiliza con frecuencia en estudios de imagen microespectroscópica/química, o microscópicos, para monitorizar las interacciones proteína-proteína espaciales y temporales, las propiedades de las membranas y las interacciones con ácidos nucleicos en células vivas.
  • Gadella TW Jr., Técnicas FRET y FLIM , 33. Editorial: Elsevier, ISBN 978-0-08-054958-3, (2008) 560 páginas.
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