Cromatografía

La cromatografía en columna es una técnica de separación en la que el lecho estacionario se encuentra dentro de un tubo. Las partículas de la fase estacionaria sólida o el soporte recubierto con una fase estacionaria líquida pueden llenar todo el volumen interno del tubo (columna empaquetada) o concentrarse en o a lo largo de la pared interna del tubo, dejando un camino abierto y sin restricciones para la fase móvil en la parte central del tubo (columna tubular abierta). Las diferencias en las velocidades de movimiento a través del medio se calculan para obtener diferentes tiempos de retención de la muestra. ^{[ 12 ] [ 13 ]} En 1978, W. Clark Still introdujo una versión modificada de la cromatografía en columna llamada cromatografía flash en columna (flash). ^{[ 14 ] [ 15 ]} La técnica es muy similar a la cromatografía en columna tradicional, excepto que el solvente se impulsa a través de la columna aplicando presión positiva. Esto permitió que la mayoría de las separaciones se realizaran en menos de 20 minutos, con separaciones mejoradas en comparación con el método antiguo. Los sistemas modernos de cromatografía flash se venden como cartuchos de plástico preempaquetados, y el solvente se bombea a través del cartucho. Los sistemas también pueden conectarse con detectores y colectores de fracciones, lo que permite la automatización. La introducción de bombas de gradiente dio como resultado separaciones más rápidas y un menor consumo de solventes.

En la adsorción en lecho expandido , se utiliza un lecho fluidizado en lugar de una fase sólida formada por un lecho empacado. Esto permite omitir pasos de clarificación iniciales, como la centrifugación y la filtración, para caldos de cultivo o suspensiones de células rotas.

La cromatografía de fosfocelulosa utiliza la afinidad de unión de muchas proteínas de unión al ADN por la fosfocelulosa. Cuanto más fuerte sea la interacción de una proteína con el ADN, mayor será la concentración de sal necesaria para eluir dicha proteína. ^{[ 16 ]}

La cromatografía planar es una técnica de separación en la que la fase estacionaria se presenta en forma plana o sobre un plano. Este plano puede ser papel, que actúa como tal o está impregnado con una sustancia que forma el lecho estacionario ( cromatografía en papel ), o una capa de partículas sólidas extendidas sobre un soporte, como una placa de vidrio ( cromatografía de capa fina ). Los diferentes compuestos de la mezcla de la muestra recorren distancias distintas según la intensidad de su interacción con la fase estacionaria en comparación con la fase móvil. El factor de retención específico (Rf ₎ de cada sustancia química puede utilizarse para facilitar la identificación de una sustancia desconocida.

Cromatografía en papel

La cromatografía en papel es una técnica que consiste en depositar una pequeña gota o línea de solución de muestra sobre una tira de papel cromatográfico . El papel se coloca en un recipiente con una capa fina de disolvente y se sella. A medida que el disolvente asciende a través del papel, se encuentra con la mezcla de la muestra, que comienza a ascender junto con el disolvente. Este papel está hecho de celulosa , una sustancia polar , y los compuestos de la mezcla se desplazan más lejos si son menos polares. Las sustancias más polares se unen al papel de celulosa con mayor rapidez y, por lo tanto, no se desplazan tan lejos.

Cromatografía de capa fina (TLC)

La cromatografía de capa fina (TLC) es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada para separar diferentes compuestos bioquímicos en función de su afinidad relativa por las fases estacionaria y móvil. Es similar a la cromatografía en papel . Sin embargo, en lugar de utilizar una fase estacionaria de papel, emplea una fase estacionaria de una fina capa de adsorbente , como gel de sílice , alúmina o celulosa, sobre un sustrato plano e inerte . La TLC es muy versátil; permite separar simultáneamente múltiples muestras en la misma capa, lo que la hace muy útil para aplicaciones de cribado, como la determinación de niveles de fármacos y la pureza del agua. ^{[ 17 ]}

La posibilidad de contaminación cruzada es baja, ya que cada separación se realiza en una capa nueva. En comparación con el papel, ofrece la ventaja de una mayor velocidad de análisis, mejores separaciones, un análisis cuantitativo más preciso y la posibilidad de elegir entre diferentes adsorbentes. Para una resolución aún mejor y una separación más rápida con menor consumo de disolvente, se puede utilizar la cromatografía de capa fina de alto rendimiento (TLC ). Un uso popular anterior consistía en diferenciar cromosomas observando la distancia en el gel (la separación era un paso aparte).

La cromatografía de gases (CG), también conocida como cromatografía gas-líquido (CG), es una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. La separación cromatográfica de gases siempre se lleva a cabo en una columna, que suele ser de relleno o capilar. Las columnas de relleno son las más utilizadas en cromatografía de gases, ya que son más económicas y fáciles de usar, y a menudo ofrecen un rendimiento adecuado. Las columnas capilares generalmente proporcionan una resolución muy superior y, aunque son más caras, su uso se está extendiendo, especialmente para mezclas complejas. Además, las columnas capilares se pueden dividir en tres clases: tubulares abiertas con capa porosa (PLOT), tubulares abiertas con recubrimiento de pared (WCOT) y tubulares abiertas con soporte (SCOT). Las columnas PLOT son únicas porque la fase estacionaria está adsorbida a las paredes de la columna, mientras que las columnas WCOT tienen una fase estacionaria unida químicamente a las paredes. Las columnas SCOT son, en cierto modo, una combinación de los dos tipos mencionados, ya que tienen partículas de soporte adheridas a las paredes de la columna, pero estas partículas tienen la fase líquida unida químicamente a ellas. ^{[ 19 ]} Ambos tipos de columna están hechos de materiales no adsorbentes y químicamente inertes. El acero inoxidable y el vidrio son los materiales habituales para las columnas de relleno y el cuarzo o la sílice fundida para las columnas capilares.

La cromatografía de gases se basa en el equilibrio de partición del analito entre una fase estacionaria sólida o líquida viscosa (a menudo un material líquido a base de silicona) y un gas móvil (generalmente helio). La fase estacionaria se adhiere a la pared interna de un tubo de vidrio o sílice fundida de pequeño diámetro (comúnmente de 0,53 a 0,18 mm de diámetro interno) (columna capilar) o a una matriz sólida dentro de un tubo metálico más grande (columna empaquetada). Se utiliza ampliamente en química analítica ; si bien las altas temperaturas empleadas en la cromatografía de gases la hacen inadecuada para biopolímeros o proteínas de alto peso molecular (el calor los desnaturaliza), frecuentes en bioquímica , resulta muy apropiada para su uso en los campos petroquímico , de monitoreo y remediación ambiental , y de química industrial . También se utiliza extensamente en la investigación química.

La cromatografía líquida (LC) es una técnica de separación en la que la fase móvil es líquida. Puede realizarse en columna o en fase líquida. La cromatografía líquida actual, que generalmente utiliza partículas de relleno muy pequeñas y una presión relativamente alta, se denomina cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) .

En HPLC, la muestra es forzada por un líquido a alta presión (la fase móvil) a través de una columna que está empaquetada con una fase estacionaria compuesta por partículas de forma irregular o esférica, una capa monolítica porosa o una membrana porosa. Los monolitos son "medios cromatográficos esponjosos" ^{[ 2 ]} y están formados por un bloque continuo de partes orgánicas o inorgánicas. Históricamente, la HPLC se divide en dos subclases diferentes según la polaridad de las fases móvil y estacionaria. Los métodos en los que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil (por ejemplo, tolueno como fase móvil, sílice como fase estacionaria) se denominan cromatografía líquida de fase normal (NPLC) y lo contrario (por ejemplo, mezcla de agua-metanol como fase móvil y C18 ( octadecilsililo ) como fase estacionaria) se denomina cromatografía líquida de fase inversa (RPLC).

Una especialización de la cromatografía líquida es la nanocromatografía líquida (nano-LC). ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

La cromatografía de fluidos supercríticos es una técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido cuya temperatura y presión se encuentran por encima o relativamente cerca de sus valores críticos.

La cromatografía de afinidad ^{[ 23 ]} se basa en la interacción selectiva no covalente entre un analito y moléculas específicas. Es muy específica, pero no muy robusta. ^{[ 24 ]} Se utiliza frecuentemente en bioquímica para la purificación de proteínas unidas a marcadores. Estas proteínas de fusión se marcan con compuestos como etiquetas de histidina , biotina o antígenos , que se unen específicamente a la fase estacionaria. Tras la purificación, estos marcadores suelen eliminarse y se obtiene la proteína pura.

La cromatografía de afinidad suele aprovechar la afinidad de una biomolécula por los cationes de un metal (Zn, Cu, Fe, etc.). Las columnas se preparan a menudo manualmente y pueden diseñarse específicamente para las proteínas de interés. Las columnas de afinidad tradicionales se utilizan como paso preparatorio para eliminar biomoléculas no deseadas o como paso inicial en el análisis de una proteína con propiedades físicas desconocidas. ^{[ 25 ]}

Sin embargo, existen técnicas de cromatografía líquida que sí utilizan propiedades de cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) ^{[ 26 ] [ 27 ]} es útil para separar las moléculas mencionadas anteriormente en función de su afinidad relativa por el metal. A menudo, estas columnas se pueden cargar con diferentes metales para crear una columna con una afinidad específica. ^{[ 28 ]}

La cromatografía de intercambio iónico (generalmente denominada cromatografía iónica) utiliza un mecanismo de intercambio iónico para separar analitos en función de sus respectivas cargas. Generalmente se realiza en columnas, pero también puede ser útil en modo planar. La cromatografía de intercambio iónico utiliza una fase estacionaria cargada para separar compuestos cargados, incluidos aniones , cationes , aminoácidos , péptidos y proteínas . En los métodos convencionales, la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos funcionales cargados que interactúan con grupos de carga opuesta del compuesto para retenerlos. Existen dos tipos de cromatografía de intercambio iónico: intercambio catiónico e intercambio aniónico. En la cromatografía de intercambio catiónico, la fase estacionaria tiene carga negativa y el ion intercambiable es un catión, mientras que, en la cromatografía de intercambio aniónico, la fase estacionaria tiene carga positiva y el ion intercambiable es un anión. ^{[ 29 ]} La cromatografía de intercambio iónico se utiliza comúnmente para purificar proteínas mediante FPLC .

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), también conocida como cromatografía de permeación en gel (GPC) o cromatografía de filtración en gel , separa las moléculas según su tamaño (o, más precisamente, según su diámetro hidrodinámico o volumen hidrodinámico). Las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros del medio y, por lo tanto, quedan atrapadas y se eliminan del flujo de la fase móvil. El tiempo medio de residencia en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas del analito. Sin embargo, las moléculas que superan el tamaño medio de los poros del relleno quedan excluidas y, por consiguiente, prácticamente no se retienen; estas especies son las primeras en eluirse. Generalmente, se trata de una técnica cromatográfica de baja resolución, por lo que suele reservarse para la etapa final de purificación. También resulta útil para determinar la estructura terciaria y cuaternaria de proteínas purificadas, especialmente porque puede realizarse en condiciones de solución nativa.

Una columna de cromatografía de adsorción de lecho expandido (EBA) para un proceso de separación bioquímica comprende un distribuidor de líquido de ecualización de presión con función de autolimpieza debajo de una placa de tamiz poroso en la parte inferior del lecho expandido, un conjunto de boquillas en la parte superior con función de limpieza por retrolavado en la parte superior del lecho expandido, y una mejor distribución del licor de alimentación añadido al lecho expandido asegurando que el fluido que pasa a través de la capa del lecho expandido muestre un estado de flujo pistón. La capa del lecho expandido muestra un estado de flujo pistón. La columna de separación cromatográfica de lecho expandido tiene ventajas al aumentar la eficiencia de separación del lecho expandido.

La cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA) es una técnica práctica y eficaz para la captura de proteínas directamente de muestras crudas sin clarificar. En la cromatografía EBA, el lecho sedimentado se expande inicialmente mediante un flujo ascendente de tampón de equilibrio. La muestra cruda, que es una mezcla de proteínas solubles, contaminantes, células y restos celulares, se hace pasar a través del lecho expandido. Las proteínas objetivo se capturan en el adsorbente, mientras que las partículas y los contaminantes lo atraviesan. Un cambio a tampón de elución, manteniendo el flujo ascendente, da como resultado la desorción de la proteína objetivo en el modo de lecho expandido. Alternativamente, si se invierte el flujo, las partículas adsorbidas se sedimentan rápidamente y las proteínas pueden desorberse con un tampón de elución. El modo de elución utilizado (lecho expandido o lecho sedimentado) depende de las características de la muestra. Después de la elución, el adsorbente se limpia con una solución de limpieza in situ (CIP) predefinida, seguida de la regeneración de la columna (para su posterior uso) o su almacenamiento.

La cromatografía de fase inversa (CPI) es cualquier procedimiento de cromatografía líquida en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria. Se denomina así porque, en la cromatografía líquida de fase normal, la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria. Las moléculas hidrofóbicas de la fase móvil tienden a adsorberse a la fase estacionaria, que es relativamente hidrofóbica. Las moléculas hidrofílicas de la fase móvil tienden a eluir primero. Las columnas de separación suelen estar compuestas por una cadena de carbono C8 o C18 unida a un sustrato de partículas de sílice.

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una técnica de purificación y análisis que separa analitos, como proteínas, basándose en las interacciones hidrofóbicas entre el analito y la matriz cromatográfica. Puede proporcionar un enfoque ortogonal no desnaturalizante a la separación de fases inversa, preservando las estructuras nativas y potencialmente la actividad proteica. En la cromatografía de interacción hidrofóbica, el material de la matriz se sustituye ligeramente con grupos hidrofóbicos. Estos grupos pueden ser metilo, etilo, propilo, butilo, octilo o fenilo. ^{[ 30 ]} A altas concentraciones de sal, las cadenas laterales no polares en la superficie de las proteínas "interactúan" con los grupos hidrofóbicos; es decir, ambos tipos de grupos son excluidos por el disolvente polar (los efectos hidrofóbicos se incrementan con el aumento de la fuerza iónica). Por lo tanto, la muestra se aplica a la columna en un tampón altamente polar, lo que impulsa una asociación de parches hidrofóbicos en el analito con la fase estacionaria. El eluyente suele ser una solución tampón acuosa con concentraciones decrecientes de sal, concentraciones crecientes de detergente (que interrumpe las interacciones hidrofóbicas) o cambios de pH. El tipo de sal utilizada es de vital importancia, ya que las sales cosmotrópicas , según la serie de Hofmeister, proporcionan la mayor estructuración del agua alrededor de la molécula y la consiguiente presión hidrofóbica. El sulfato de amonio se utiliza frecuentemente para este fin. La adición de disolventes orgánicos u otros componentes menos polares puede contribuir a mejorar la resolución.

En general, la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es ventajosa si la muestra es sensible a cambios de pH o disolventes agresivos que se utilizan habitualmente en otros tipos de cromatografía, pero no a altas concentraciones de sal. Comúnmente, es la cantidad de sal en el tampón la que se varía. En 2012, Müller y Franzreb describieron los efectos de la temperatura en la HIC utilizando albúmina de suero bovino (BSA) con cuatro tipos diferentes de resina hidrofóbica . El estudio alteró la temperatura para afectar la afinidad de unión de la BSA a la matriz. Se concluyó que el ciclo de temperatura de 40 a 10 grados Celsius no sería suficiente para lavar eficazmente toda la BSA de la matriz, pero podría ser muy eficaz si la columna se utilizara solo unas pocas veces. ^{[ 31 ]} Utilizar la temperatura para producir cambios permite a los laboratorios reducir los costos de compra de sal y ahorrar dinero.

Si se desean evitar altas concentraciones de sal junto con fluctuaciones de temperatura, se puede utilizar un agente más hidrofóbico para competir con la muestra y eluirla. Este método de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), denominado independiente de la sal, demostró un aislamiento directo de inmunoglobulina G humana (IgG) del suero con un rendimiento satisfactorio y utilizó β-ciclodextrina como competidor para desplazar la IgG de la matriz. ^{[ 32 ]} Esto amplía considerablemente la posibilidad de utilizar HIC con muestras sensibles a la sal, ya que sabemos que las altas concentraciones de sal precipitan las proteínas.

La cromatografía de interacción hidrofílica ( HILIC ) es un tipo de cromatografía líquida que utiliza unafase estacionaria hidrofílica y una fase móvil con alto contenido orgánico para la separación de analitos por polaridad . ^{[ 33 ]} La HILIC es similar a la cromatografía de fase inversa en la composición de su fase móvil, y también a la cromatografía de fase normal , con su fase estacionaria polar, pero tiene mecanismos distintos. ^{[ 34 ] [ 35 ]} Los analitos más hidrofóbicos eluyen primero, en un orden que generalmente es opuesto al de la cromatografía de fase inversa. ^{[ 36 ]} En la HILIC, los analitos se distribuyen entre la fase móvil rica en materia orgánica y una capa enriquecida en agua que se forma en la superficie de la fase estacionaria polar, ^{[ 35 ]} con los analitos más polares teniendo interacciones más fuertes y siendo retenidos en la columna durante más tiempo. ^{[ 37 ]} Los enlaces de hidrógeno y las interacciones electrostáticas con la fase estacionaria también contribuyen al mecanismo de separación. ^{[ 38 ]} HILIC puede utilizarse con un sistema de tampón isocrático, pero se utiliza más comúnmente con un gradiente, aumentando la hidrofilicidad del tampón al aumentar su contenido acuoso para que se eluyan cada vez más analitos hidrofílicos. ^{[ 36 ]}

HILIC puede utilizarse para la separación de muchos tipos de analitos, pero se usa comúnmente en estudios de metabolómica, donde es muy adecuada para separar metabolitos polares. ^{[ 39 ] [ 38 ]} HILIC es ortogonal a la cromatografía de fase inversa y puede combinarse como un enfoque ortogonal para una cobertura más completa. ^{[ 40 ] [ 36 ]}

La cromatografía hidrodinámica (HDC) se deriva del fenómeno observado de que las gotas grandes se mueven más rápido que las pequeñas. ^{[ 41 ]} En una columna, esto sucede porque el centro de masa de las gotas más grandes no puede estar tan cerca de los lados de la columna como las gotas más pequeñas debido a su mayor tamaño total. ^{[ 42 ]} Las gotas más grandes eluirán primero desde el centro de la columna, mientras que las gotas más pequeñas se adhieren a los lados de la columna y eluirán al final. Esta forma de cromatografía es útil para separar analitos por masa molar (o masa molecular), tamaño, forma y estructura cuando se utiliza junto con detectores de dispersión de luz , viscosímetros y refractómetros . ^{[ 43 ]} Los dos tipos principales de HDC son tubo abierto y columna empaquetada . El tubo abierto ofrece tiempos de separación rápidos para partículas pequeñas, mientras que la HDC de columna empaquetada puede aumentar la resolución y es más adecuada para partículas con una masa molecular promedio mayor que${\displaystyle 10^{5}}$daltons . ^{[ 44 ]} La HDC se diferencia de otros tipos de cromatografía porque la separación solo tiene lugar en el volumen intersticial, que es el volumen que rodea y se encuentra entre las partículas en una columna empaquetada. ^{[ 45 ]}

La HDC comparte el mismo orden de elución que la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), pero ambos procesos difieren en muchos aspectos. ^{[ 44 ]} En un estudio que compara los dos tipos de separación, Isenberg, Brewer, Côté y Striegel utilizan ambos métodos para la caracterización de polisacáridos y concluyen que la HDC acoplada con dispersión de luz multiángulo (MALS) logra una distribución de masa molar más precisa en comparación con la MALS fuera de línea que la SEC en un tiempo significativamente menor. ^{[ 46 ]} Esto se debe en gran medida a que la SEC es una técnica más destructiva debido a que los poros de la columna degradan el analito durante la separación, lo que tiende a afectar la distribución de masa. ^{[ 46 ]} Sin embargo, la principal desventaja de la HDC es la baja resolución de los picos del analito, lo que hace que la SEC sea una opción más viable cuando se utiliza con productos químicos que no se degradan fácilmente y donde la elución rápida no es importante. ^{[ 47 ]}

La HDC desempeña un papel especialmente importante en el campo de la microfluídica . El primer aparato exitoso para el sistema HDC-on-a-chip fue propuesto por Chmela, et al. en 2002. ^{[ 48 ]} Su diseño fue capaz de lograr separaciones utilizando un  canal de 80 mm de longitud en una escala de tiempo de 3 minutos para partículas con diámetros que van desde 26 a 110  nm, pero los autores expresaron la necesidad de mejorar los parámetros de retención y dispersión . ^{[ 48 ]} En una publicación de 2010 de Jellema, Markesteijn, Westerweel y Verpoorte, la implementación de HDC con un flujo bidireccional recirculante resultó en una separación basada en el tamaño de alta resolución con solo un  canal de 3 mm de longitud. ^{[ 49 ]} Tener un canal tan corto y alta resolución se consideró especialmente impresionante considerando que los estudios anteriores utilizaron canales de 80  mm de longitud. ^{[ 48 ]} Para una aplicación biológica, en 2007, Huh, et al. Se propuso un dispositivo de clasificación microfluídica basado en HDC y gravedad, que resultó útil para evitar que partículas potencialmente peligrosas con un diámetro mayor a 6 micras ingresaran al torrente sanguíneo al inyectar agentes de contraste en ecografías . ^{[ 50 ]} Este estudio también hizo avances en sostenibilidad ambiental en microfluídica debido a la ausencia de electrónica externa que impulsa el flujo, lo cual fue una ventaja del uso de un dispositivo basado en gravedad.

En algunos casos, la selectividad proporcionada por el uso de una columna puede ser insuficiente para proporcionar resolución de analitos en muestras complejas. La cromatografía bidimensional tiene como objetivo aumentar la resolución de estos picos mediante el uso de una segunda columna con diferentes propiedades fisicoquímicas ( clasificación química ). ^{[ 51 ] [ 52 ]} Dado que el mecanismo de retención en este nuevo soporte sólido es diferente de la separación de la primera dimensión, es posible separar compuestos mediante cromatografía bidimensional que son indistinguibles mediante cromatografía unidimensional. Además, la separación en la segunda dimensión ocurre más rápido que en la primera dimensión. ^{[ 51 ]} Un ejemplo de una separación TDC es donde la muestra se aplica en una esquina de una placa cuadrada, se desarrolla, se seca al aire, luego se rota 90° y generalmente se vuelve a desarrollar en un segundo sistema de solventes.

La cromatografía bidimensional se puede aplicar a separaciones GC o LC. ^{[ 51 ] [ 52 ]} El método de corte de corazón selecciona una región de interés específica en la primera dimensión para la separación, ^{[ 53 ]} y el método integral utiliza todos los analitos en la separación de la segunda dimensión. ^{[ 51 ] [ 52 ]}

La técnica de lecho móvil simulado (SMB) es una variante de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); se utiliza para separar partículas y/o compuestos químicos que serían difíciles o imposibles de resolver de otra manera. Esta mayor separación se logra mediante un sistema de válvulas y columnas que prolonga indefinidamente la fase estacionaria. En la técnica de lecho móvil de la cromatografía preparativa, la entrada de la muestra y la recuperación del analito son simultáneas y continuas, pero debido a las dificultades prácticas de un lecho móvil continuo, se propuso la técnica de lecho móvil simulado (SMBC). En la técnica SMBC, en lugar de mover el lecho, las posiciones de entrada de la muestra y salida del analito se mueven continuamente, dando la impresión de un lecho móvil. La cromatografía de lecho móvil real (TMBC) es solo un concepto teórico. Su simulación, la SMBC, se logra mediante el uso de múltiples columnas en serie y un sistema complejo de válvulas. Este sistema de válvulas permite la alimentación de muestras y disolventes, así como la toma de analitos y residuos en los puntos adecuados de cualquier columna, lo que posibilita alternar a intervalos regulares la entrada de la muestra en una dirección y la entrada del disolvente en la dirección opuesta, al tiempo que se modifican adecuadamente las posiciones de toma de analitos y residuos.

La pirólisis-cromatografía de gases-espectrometría de masas es un método de análisis químico en el que la muestra se calienta hasta su descomposición para producir moléculas más pequeñas que se separan mediante cromatografía de gases y se detectan mediante espectrometría de masas.

La pirólisis es la descomposición térmica de materiales en atmósfera inerte o al vacío. La muestra se coloca en contacto directo con un hilo de platino o en un tubo de cuarzo y se calienta rápidamente a 600–1000  °C. Dependiendo de la aplicación, se utilizan temperaturas aún más altas. En los pirólisis actuales se emplean tres técnicas de calentamiento diferentes: horno isotérmico, calentamiento inductivo (filamento de punto de Curie) y calentamiento resistivo mediante filamentos de platino. Las moléculas grandes se rompen en sus puntos más débiles y producen fragmentos más pequeños y volátiles. Estos fragmentos se pueden separar mediante cromatografía de gases. Los cromatogramas de GC de pirólisis suelen ser complejos debido a la amplia gama de productos de descomposición que se forman. Los datos se pueden utilizar como huellas dactilares para demostrar la identidad del material o bien, los datos de GC/MS se utilizan para identificar fragmentos individuales y obtener información estructural. Para aumentar la volatilidad de los fragmentos polares, se pueden añadir diversos reactivos metilantes a la muestra antes de la pirólisis.

Además del uso de pirólisisdores específicos, la cromatografía de gases (GC) de pirólisis de muestras sólidas y líquidas puede realizarse directamente en inyectores de vaporizador de temperatura programable (PTV), que proporcionan un calentamiento rápido (hasta 30  °C/s) y altas temperaturas máximas de 600–650  °C. Esto es suficiente para algunas aplicaciones de pirólisis. La principal ventaja es que no es necesario adquirir un instrumento específico y la pirólisis puede realizarse como parte del análisis GC rutinario. En este caso, se deben utilizar revestimientos de entrada de cuarzo para GC. Se pueden obtener datos cuantitativos y también se publican buenos resultados de derivatización dentro del inyector PTV.

La cromatografía líquida de proteínas de alta resolución (FPLC) es una forma de cromatografía líquida que se utiliza frecuentemente para analizar o purificar mezclas de proteínas. Al igual que en otras formas de cromatografía, la separación es posible gracias a que los diferentes componentes de una mezcla tienen distintas afinidades por dos materiales: un fluido móvil (la "fase móvil") y un sólido poroso (la fase estacionaria). En FPLC, la fase móvil es una solución acuosa o "tampón". El caudal del tampón se controla mediante una bomba de desplazamiento positivo y normalmente se mantiene constante, mientras que su composición puede variarse extrayendo fluidos en diferentes proporciones de dos o más depósitos externos. La fase estacionaria es una resina compuesta por microesferas, generalmente de agarosa reticulada , empaquetadas en una columna cilíndrica de vidrio o plástico. Las resinas FPLC están disponibles en una amplia gama de tamaños de microesferas y ligandos superficiales, según la aplicación.

La cromatografía a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido, donde tanto la fase estacionaria como la móvil son líquidas y la fase estacionaria líquida se mantiene estancada por una fuerte fuerza centrífuga. ^{[ 54 ]}

A diferencia de la cromatografía a contracorriente (véase más arriba), la cromatografía periódica a contracorriente (PCC) utiliza una fase estacionaria sólida y solo una fase móvil líquida. Por lo tanto, se asemeja mucho más a la cromatografía de afinidad convencional que a la cromatografía a contracorriente. La PCC utiliza varias columnas que, durante la fase de carga, se conectan en línea. Este modo permite sobrecargar la primera columna de la serie sin perder producto, que ya atraviesa la columna antes de que la resina esté completamente saturada. El producto que atraviesa la columna se retiene en las columnas siguientes. A continuación, las columnas se desconectan entre sí. La primera columna se lava y se eluye, mientras que las demás se siguen cargando. Una vez que la primera columna (inicialmente) se reequilibra, se reintroduce en la corriente de carga, pero como última columna. El proceso continúa entonces de forma cíclica.

La cromatografía quiral implica la separación de estereoisómeros . En el caso de los enantiómeros, estos no presentan diferencias químicas ni físicas, salvo ser imágenes especulares tridimensionales. Para que se produzcan separaciones quirales, la fase móvil o la fase estacionaria deben ser quirales, lo que genera diferentes afinidades entre los analitos. Existen en el mercado columnas de cromatografía HPLC quiral (con fase estacionaria quiral) tanto en fase normal como en fase inversa.

La cromatografía convencional es incapaz de separar mezclas racémicas de enantiómeros. Sin embargo, en algunos casos, las mezclas no racémicas de enantiómeros pueden separarse inesperadamente mediante cromatografía líquida convencional (por ejemplo, HPLC sin fase móvil quiral o fase estacionaria). ^{[ 55 ] [ 56 ]}

La cromatografía acuosa de fase normal (ANP) se caracteriza por el comportamiento de elución del modo de fase normal clásico (es decir, donde la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria), en el que el agua es uno de los componentes del sistema de disolventes de la fase móvil. Se distingue de la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) en que el mecanismo de retención se debe a la adsorción en lugar de a la partición. ^{[ 57 ]}