Peinado cromosómico

El peinado cromosómico (también conocido como peinado molecular o peinado de ADN) ^{[ 1 ]} es una técnica utilizada para producir una matriz de ADN estirado uniformemente que luego es muy adecuada para estudios de hibridación de ácidos nucleicos como la hibridación fluorescente in situ (FISH), que se benefician de la uniformidad del estiramiento, el fácil acceso a las secuencias objetivo de hibridación, ^{[ 2 ]} y la resolución que ofrece la gran distancia entre dos sondas, que se debe al estiramiento del ADN por un factor de 1,5 veces la longitud cristalográfica del ADN.

El ADN en solución (es decir, con una estructura enrollada aleatoriamente) se estira al retraer el menisco de la solución a una velocidad constante (típicamente 300  μm/s). Los extremos de las hebras de ADN, que se cree que están deshilachados (es decir, abiertos y exponiendo grupos polares), se unen a grupos ionizables que recubren una placa de vidrio silanizada a un pH inferior al pKa de los grupos ionizables (lo que garantiza que estén suficientemente cargados para interactuar con los extremos del ADN). El resto del ADN, que es principalmente ADN bicatenario, no puede formar estas interacciones (aparte de unos pocos segmentos de "contacto" a lo largo de la hebra de ADN), por lo que está disponible para la hibridación con sondas. A medida que el menisco se retrae, la retención de la superficie crea una fuerza que actúa sobre el ADN para retenerlo en la fase líquida; sin embargo, esta fuerza es inferior a la fuerza de la unión del ADN; el resultado es que el ADN se estira al entrar en la fase gaseosa; Dado que la fuerza actúa en la interfaz aire/líquido, es invariable para diferentes longitudes o conformaciones del ADN en solución, por lo que el ADN de cualquier longitud se estirará de la misma manera al retraerse el menisco. Como este estiramiento es constante a lo largo de la cadena de ADN, la distancia a lo largo de la hebra puede relacionarse con el contenido de bases; 1  μm equivale aproximadamente a 2  kb.

Las regiones de ADN de interés se observan mediante hibridación con sondas marcadas con haptenos como la biotina ; esto puede unirse a una o más capas de ligandos asociados a fluorocromos (como anticuerpos de inmunofluorescencia). También es posible el etiquetado multicolor. Esto tiene varios usos potenciales, típicamente como una técnica de mapeo físico de alta resolución (por ejemplo, para clonación posicional), un ejemplo de la cual fue el mapeo correcto de 200  kb de la región del gen CAPN3, o el mapeo de secuencias no superpuestas (ya que la distancia entre dos sondas se puede medir con precisión). Por lo tanto, es útil para encontrar exones, microdeleciones, amplificaciones o reordenamientos. Antes de la mejora del peinado, FISH tenía una resolución demasiado baja para ser útil en este caso. Con esta técnica, la resolución de FISH está teóricamente limitada solo por la resolución del microscopio de epifluorescencia ; En la práctica,  se obtienen resoluciones de alrededor de 2 μm para moléculas de ADN de entre 200 y 600  kb de longitud (aunque la técnica combing-FISH se ha utilizado con cierto éxito en moléculas de más de 1  Mb), y existe margen de mejora mediante la optimización. Dado que los análisis de ADN que utilizan esta técnica se realizan a nivel de molécula individual, se pueden comparar genomas de diferentes células para detectar anomalías, lo que tiene implicaciones para el diagnóstico del cáncer y otras alteraciones genéticas.

El peinado cromosómico también se utiliza para estudiar la replicación del ADN , un proceso altamente regulado que depende de un programa específico de distribución temporal y espacial de la activación de los orígenes de replicación . Cada origen ocupa un locus genético distinto y debe activarse solo una vez por ciclo celular . El peinado cromosómico permite una visión global del inicio de la replicación y la propagación de las horquillas de replicación . Dado que no se hacen suposiciones sobre la secuencia de los orígenes, esta técnica es particularmente útil para mapear los orígenes en eucariotas , que no se cree que tengan secuencias de iniciación definidas con precisión.

Las estrategias que implican el análisis del ADN recientemente replicado suelen consistir en la incorporación de nucleótidos modificados (como BrdU, bromodesoxiuridina ) al ADN naciente, para luego detectarlo mediante fluorescencia. Dado que las horquillas de replicación se propagan bidireccionalmente desde los orígenes de replicación a velocidades (aproximadamente) iguales, ^{[ 3 ]} se puede inferir la posición del origen. Reemplazar el conjunto de nucleótidos modificados con un tipo diferente de nucleótido modificado después de un cierto tiempo permite desarrollar una imagen con resolución temporal de la activación de los sitios y la cinética de las horquillas de replicación. Se pueden identificar los sitios de pausa, resolver las horquillas de replicación fusionadas y estudiar la frecuencia de activación de los orígenes en diferentes periodos de tiempo.

En estudios in vitro con extracto de óvulos de Xenopus laevis, se ha demostrado que las frecuencias de disparo aumentan a medida que avanza la fase S. En otro estudio ^{[ 4 ]} sobre episomas del virus de Epstein-Barr , se utilizaron sondas hibridadas para visualizar la distribución regional de los eventos de disparo; una zona en particular mostró preferencia por el disparo, mientras que también se infirieron algunos sitios de pausa.

El análisis cromosómico lo realiza la empresa Genomic Vision, con sede en París.