Quimopapaína

La quimopapaína ( EC 3.4.22.6, quimopapaína A , quimopapaína B , quimopapaína S , nombre comercial Quimodiactina ) es una enzima proteolítica aislada del látex de la papaya ( Carica papaya ). Es una cisteína proteasa que pertenece al grupo de las proteasas similares a la papaína (PLCP). ^[1] Debido a su actividad proteolítica, es la molécula principal en el proceso de quimionucleólisis, utilizada en algunos procedimientos como el tratamiento de hernias discales lumbares inferiores en la columna mediante un método no quirúrgico. ^[2]

El zimógeno de la quimopapaína está formado por un total de 352 residuos y tiene un peso de aproximadamente 23,78 kDa. ^[3] Se pueden distinguir tres regiones diferentes dentro de la cadena del precursor. ^[3]

• Los primeros 18 aminoácidos actúan como una señal de clasificación al indicar el destino final de la quimopapaína dentro de la célula cuando es clasificada por el aparato de Golgi . ^[3] Aunque este destino final aún no se ha estudiado por completo, otras PLCP están contenidas en lisosomas y otras vesículas acidificadas y se cree que la quimopapaína también está en estas mismas vesículas. ^{[1] [4]} También se sabe que la quimopapaína se secreta fuera de la célula. ^[5]
• La segunda región está constituida por los residuos 19 al 134, los cuales conforman un propéptido que será removido al activarse una vez que la quimopapaína alcance su destino final dentro de la célula. ^[3] Esta región permite que la proteína se pliegue adecuadamente en el retículo endoplasmático y que estabilice la cadena en diferentes condiciones de acidez, ya que su pH óptimo varía de 3,5 a 10 dependiendo del sustrato. ^[6] Por lo tanto, la capacidad de trabajar en condiciones de pH bajo apoya la idea de que la quimopapaína puede encontrarse en los lisosomas . ^{[1] [4]} El propéptido está plegado de una manera que evita que los sustratos entren en el sitio activo , bloqueando así la actividad proteolítica hasta que sea escindido. ^{[7] [8]}
• El resto de la proteína -residuos 135 a 352- conforma la cadena madura de la quimopapaína. ^[3] En esta región se pueden destacar tres aminoácidos que son Cys159, His293 y Asn313, ya que constituyen la tríada catalítica de la enzima. ^[3] Cys159 e His293 son los dos residuos que realizan la catálisis del sustrato mientras que Asn313 interacciona con Cys159 y orienta adecuadamente su anillo de imidazolio para permitir que la reacción ocurra, cumpliendo así también una función esencial en la catálisis. ^[9]

La estructura de la quimopapaína se resolvió mediante técnicas de difracción de rayos X. ^[3] El análisis de esta estructura mostró que la quimopapaína tiene 7 regiones de hélice alfa , 10 regiones de lámina beta y 2 giros de bucle. ^[3] Estos 2 giros son la principal diferencia entre la estructura de la quimopapaína y otras proteínas proteinasas de papaya como la papaína o la caricaína , que tienen conformaciones similares. ^{[11] [12]}

Además, la quimopapaína presenta 3 enlaces disulfuro como modificaciones postraduccionales establecidas entre los residuos 156-197, 190-229 y 287-338. ^[3]

La quimopapaína presenta una estructura cuaternaria caracterizada por la formación de homodímeros , lo que significa que dos cadenas de quimopapaína se unen entre sí a través de interacciones débiles para conformar una estructura biológica única. ^[10]

Al igual que el resto de enzimas del grupo PLCPs, la quimopapaína es una cisteína proteasa . Las proteasas son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos entre los residuos que conforman una proteína. En cada hidrólisis se libera una molécula de agua. En concreto, una cisteína proteasa es una enzima que rompe el enlace peptídico utilizando el grupo tiol de un residuo de cisteína como nucleófilo. Para hidrolizar se debe utilizar toda la tríada catalítica de la enzima. ^[1] Ésta está constituida por una cisteína , el residuo Cys159, una histidina , el residuo His203 y un tercer residuo, que suele ser una asparagina , en concreto el residuo Asn313. ^[13] Los grupos funcionales utilizados en la reacción son el grupo tiol de la cisteína y el anillo imidazolio de una histidina. El residuo de asparagina actúa orientando el anillo imidazolio de la histidina. ^[9]

El mecanismo seguido se expone a continuación: ^[9]

1. El grupo tiol de la cisteína pierde un protón, por lo que queda cargado negativamente y el grupo amino de la histidina atrapa un protón, lo que le da una carga positiva .
2. La cisteína forma un enlace con el carbono rompiendo el doble enlace del carbono con el oxígeno y convirtiéndolo en un enlace simple.
3. El grupo amino es atraído por la carga positiva de la histidina y se forma un enlace entre ambos. El enlace peptídico se rompe y el grupo carbonilo se reconstruye.
4. El grupo _NH2R se libera de la histidina. El enlace entre el grupo tiol de la cisteína y el carbono se rompe y un grupo NHR lo reemplaza.

Cuando estos dos enlaces se rompen, la tríada catalítica de la quimopapaína queda disponible nuevamente para ser utilizada.

La quimopapaína ya no se utiliza como método estándar para tratar el dolor lumbar crónico debido a sus posibles efectos secundarios. ^{[14] [15]} Por lo tanto, no es necesario sintetizarla artificialmente. De hecho, la venta y distribución de esta proteína se interrumpió en los EE. UU. en 2003.

A pesar de su enorme uso exitoso para tratar la enfermedad de hernia de disco, el uso de quimopapaína se suspendió no por riesgos o deficiencias, sino más bien porque ya no está disponible debido a la decisión de su único fabricante de detener la producción. ^[16]

Sin embargo, varios estudios han demostrado diferentes métodos exitosos para extraer y aislar la proteasa, que varían entre autores. ^{[17] [18]} El procedimiento más común es el descrito por Baines y Brocklehurst en 1979. ^[19]

Para obtener la proteína se utilizan los frutos de Carica Papaya, ya que en su látex se encuentra la quimopapaína. Las papayas deben estar justo en el paso previo a la maduración, lo que implica un diámetro promedio de 6 a 10 cm. ^[20]

Para proceder a la extracción del látex, es necesario realizar incisiones longitudinales de 2 mm de profundidad en la piel, que pueden recogerse en forma sólida unos minutos después de la extracción. Las proteasas presentes en el látex del fruto son precursores inactivos que se activan una vez que la papaya es herida. ^[21] En 0,3 ml de látex hay unos 15 mg de quimopapaína. ^[22]

Si queremos conservar las propiedades proteolíticas, el látex debe conservarse con metabisulfito de sodio y almacenarse a baja temperatura de unos -10 °C. ^[23] Si se utiliza inmediatamente después de las incisiones, se añade un tampón para extraer las proteínas: EDTA , sulfato de amonio o tampón fosfato todos con una concentración de 0,5 mM y un pH de 7.

También es importante bloquear las funciones tiol para evitar la oxidación del aire y la pérdida de actividad proteolítica. ^[21]

Para eliminar las moléculas orgánicas e insolubles, primero se filtra la muestra y luego se centrifuga a 11000g durante 30min. ^[22] Se descarta el pellet y se añade el sobrenadante a alcohol al 96% con una proporción de 1:3. ^[23] Las impurezas precipitan y se pueden eliminar por filtración. Posteriormente se realiza el fraccionamiento de (NH ₄ ) ₂ SO _{4 mediante la adición de esta sustancia a una concentración de 0,472 mg/ml.} ^[22] La quimopapaína precipita y se puede recuperar mediante otra centrifugación, nuevamente a 11000g durante 30min. Se descarta el sobrenadante y se puede realizar la cromatografía de intercambio iónico, con un gradiente lineal de 100mM (Na ⁺ ) y diferentes volúmenes de elución. Estudiando la quimopapaína A ₂₈₀ se encuentra en la fracción de 750-1000 ml. ^[21]

Una vez aislada la quimopapaína, se puede cristalizar mediante la adición gradual de cloruro de sodio a pH 2,0, lo que puede tardar hasta 4 días. ^[24]

La quimopapaína es uno de los sustratos utilizados en la quimionucleólisis (un tipo de discectomía percutánea ). ^[25] Este método fue una nueva propuesta para tratar la enfermedad discal intervertebral lumbar primaria mediante un método no quirúrgico. De hecho, el tratamiento consiste en una inyección de enzimas proteolíticas para disolver el núcleo pulposo herniado de los discos intervertebrales. La quimopapaína purificada es el componente principal de la inyección, compuesta básicamente por 20 mg en cinco mililitros. Se presenta en viales que contienen 10.000 unidades del agente liofilizado con 0,37 mg de edetato disódico, ^[26] 3,5 mg de clorhidrato de cisteína monohidrato y 1,0 mg de bisulfuro. Todos ellos funcionan como estabilizadores y activadores. El hidróxido de sodio es el encargado de ajustar el PH de la solución. Luego, la inyección se rehidrata con 5 mililitros de agua estéril.

Un cirujano inyecta la solución directamente en el disco herniado de la columna vertebral para disolver parte de él y aliviar el dolor. Este proceso está bajo control fluoroscópico. La quimopapaína es responsable de la catálisis, tanto in vivo como in vitro, de una rápida reducción de la viscosidad y, como consecuencia, del peso del núcleo pulposo . De hecho, es una despolimerización de la condromucoproteína ^[27] y una disminución de la capacidad de un disco para absorber líquido. La dosis para un solo disco intervertebral es de 2 a 4 nanokatales , con una dosis máxima por paciente de 8 nanokatales. Las inyecciones de quimopapaína normalmente se administran bajo anestesia local, en lugar de general .

Esta enzima ha sido estudiada por departamentos de universidades de todo el mundo. ^{[28] [29] [30]} Se probó tanto en animales como en humanos y, muy raramente, causó efectos secundarios graves incluyendo parálisis de las piernas y muerte . ^[31] También podría causar anafilaxia , pero solo se observó en el 1% de los pacientes que recibieron el medicamento.

La venta y distribución de quimopapaína se interrumpió en los Estados Unidos el 27 de enero de 2003, después de que la compañía que la producía decidiera dejar de venderla en todo el mundo. ^{[31] [32]}

• Papaína

• Base de datos en línea MEROPS para peptidasas y sus inhibidores: C01.002
• Ficha técnica de la papaína de BIOZYM