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El seccionamiento óptico es el proceso mediante el cual un microscopio diseñado adecuadamente puede producir imágenes nítidas de planos focales en el interior de una muestra gruesa. Esto se utiliza para reducir la necesidad de realizar cortes finos con instrumentos como el micrótomo . Se emplean diversas técnicas de seccionamiento óptico, y varias técnicas de microscopía están diseñadas específicamente para mejorar la calidad de este proceso.
Un buen seccionamiento óptico, a menudo denominado buena resolución de profundidad o resolución z, es muy popular en la microscopía moderna, ya que permite la reconstrucción tridimensional de una muestra a partir de imágenes capturadas en diferentes planos focales.
Seccionamiento óptico en microscopios de luz tradicionales
En un microscopio ideal, solo la luz del plano focal llegaría al detector (normalmente un observador o un CCD ), produciendo una imagen nítida del plano de la muestra en la que se enfoca el microscopio. Desafortunadamente, un microscopio no es tan preciso y la luz de fuentes fuera del plano focal también llega al detector; en una muestra gruesa, puede haber una cantidad significativa de material, y por lo tanto, una señal espuria, entre el plano focal y la lente del objetivo .
Sin modificar el microscopio, es decir, con un microscopio óptico de campo amplio sencillo , la calidad del seccionamiento óptico se rige por la misma física que el efecto de profundidad de campo en fotografía . Para un objetivo de alta apertura numérica , equivalente a una apertura amplia , la profundidad de campo es pequeña ( enfoque superficial ) y proporciona un buen seccionamiento óptico. Los objetivos de alta magnificación suelen tener aperturas numéricas mayores (y, por lo tanto, un mejor seccionamiento óptico) que los objetivos de baja magnificación. Los objetivos de inmersión en aceite suelen tener aperturas numéricas aún mayores, lo que mejora el seccionamiento óptico.
La resolución en la dirección de profundidad (la "resolución z") de un microscopio de campo amplio estándar depende de la apertura numérica y la longitud de onda de la luz y se puede aproximar como:
donde λ es la longitud de onda, n el índice de refracción del medio de inmersión de la lente objetivo y NA la apertura numérica. [ 2 ]
En comparación, la resolución lateral se puede aproximar como: [ 3 ]
Técnicas para mejorar el seccionamiento óptico
Microscopía óptica de campo claro
Más allá de aumentar la apertura numérica, existen pocas técnicas disponibles para mejorar el seccionamiento óptico en la microscopía de luz de campo claro. La mayoría de los microscopios con objetivos de inmersión en aceite están alcanzando los límites de apertura numérica posibles debido a las limitaciones de refracción .
La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) ofrece mejoras modestas en el seccionamiento óptico. En la DIC, la muestra se ilumina mediante dos fuentes de luz ligeramente desplazadas que interfieren entre sí para producir una imagen resultante de las diferencias de fase entre ambas. Dado que el desplazamiento entre las fuentes de luz es pequeño, la única diferencia de fase se debe al material cercano al plano focal.
microscopía de fluorescencia
En la microscopía de fluorescencia, los objetos fuera del plano focal solo interfieren con la imagen si están iluminados y emiten fluorescencia. Esto ofrece una forma adicional de mejorar el seccionamiento óptico al lograr una iluminación específica únicamente en el plano focal.
La microscopía confocal utiliza uno o varios puntos de luz para iluminar la muestra. Junto con un orificio en un plano focal conjugado, esto filtra la luz proveniente de fuentes externas al plano focal para mejorar el seccionamiento óptico. [ 4 ]
La microscopía de fluorescencia basada en lámina de luz ilumina la muestra con luz de excitación en un ángulo de 90° con respecto a la dirección de observación; es decir, solo se ilumina el plano focal mediante un láser enfocado en una sola dirección (lámina de luz). [ 5 ] Este método reduce eficazmente la luz desenfocada y, además, puede proporcionar una modesta mejora en la resolución longitudinal, en comparación con la microscopía de fluorescencia epifluorescente.
Las técnicas de excitación dual y multifotónica aprovechan el hecho de que los fluoróforos pueden excitarse no solo con un fotón de la energía correcta , sino también con múltiples fotones que, en conjunto, proporcionan dicha energía. El efecto adicional, dependiente de la concentración , que requiere que múltiples fotones interactúen simultáneamente con un fluoróforo, produce una estimulación muy cercana al plano focal. Estas técnicas se utilizan normalmente junto con la microscopía confocal. [ 6 ]
Se están desarrollando activamente mejoras adicionales en la sección óptica, que funcionan principalmente mediante métodos para sortear el límite de difracción de la luz. Algunos ejemplos incluyen la interferometría de un solo fotón a través de dos lentes objetivo para proporcionar información de profundidad extremadamente precisa sobre un solo fluoróforo [ 7 ] y la microscopía de iluminación estructurada tridimensional [ 8 ] .
La sección óptica de los microscopios de campo amplio normales se puede mejorar significativamente mediante la deconvolución , una técnica de procesamiento de imágenes para eliminar el desenfoque de la imagen según una función de dispersión de punto medida o calculada . [ 9 ]
Agentes de compensación
El seccionamiento óptico se puede mejorar mediante el uso de agentes de aclaramiento que poseen un alto índice de refracción (>1,4) como el alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) o el éter bencílico [ 10 ] que hacen que las muestras sean transparentes y, por lo tanto, permiten la observación de estructuras internas.
Otro
La técnica de seccionamiento óptico está poco desarrollada en los microscopios que no utilizan luz.
Los microscopios de rayos X y electrónicos suelen tener una gran profundidad de campo (sección óptica deficiente), por lo que la sección delgada de las muestras todavía se utiliza ampliamente.
Aunque la física similar guía el proceso de enfoque, [ 11 ] los microscopios de sonda de barrido y los microscopios electrónicos de barrido no se suelen analizar en el contexto del seccionamiento óptico, ya que estos microscopios solo interactúan con la superficie de la muestra.
La microscopía de reflexión interna total es una técnica de microscopía de fluorescencia que restringe intencionadamente la observación a la superficie superior o inferior de una muestra, pero con una resolución de profundidad extremadamente alta.
Se ha demostrado teórica y experimentalmente la obtención de imágenes 3D mediante una combinación de seccionamiento focal e inclinación para proporcionar una resolución 3D excepcional en amplios campos de visión. [ 12 ]
Alternativas
Las principales alternativas al seccionamiento óptico son:
- Corte en secciones finas de la muestra, por ejemplo, como se utiliza en histología .
- Tomografía , que está particularmente bien desarrollada para la microscopía electrónica de transmisión .
Referencias
- ^ Qian, Jia; Lei, Ming; Dan, Dan; Yao, Baoli; Zhou, Xing; Yang, Yanlong; Yan, Shaohui; Min, Junwei; Yu, Xianghua (2015). "Microscopía de corte óptico con iluminación estructurada a todo color" . Informes científicos . 5 14513. Código Bib : 2015NatSR...514513Q . doi : 10.1038/srep14513 . PMC 4586488 . PMID 26415516 .
- ↑ Nikon MicroscopyU – Profundidad de campo y profundidad de enfoque
- ↑ Nikon MicroscopyU – Resolución
- ↑ Conchello JA, Lichtman JW (diciembre de 2005). "Microscopía de seccionamiento óptico". Nat . Methods . 2 (12): 920– 31. doi : 10.1038/nmeth815 . PMID 16299477. S2CID 17722926 .
- ↑ Huisken, J.; Swoger, J.; Bene, F. Del; Wittbrodt, J.; Stelzer, EH (2004). "Sección óptica en el interior profundo de embriones vivos mediante microscopía de iluminación de plano selectivo". Science . 305 (5686): 1007– 1009. Bibcode : 2004Sci...305.1007H . CiteSeerX 10.1.1.456.2250 . doi : 10.1126/science.1100035 . PMID 15310904 . S2CID 3213175 .
- ↑ Gratton E, Barry NP, Beretta S, Celli A (septiembre de 2001). "Microscopía de fluorescencia multifotónica" . Methods . 25 ( 1): 103–10 . doi : 10.1006/meth.2001.1219 . PMID 11559001. S2CID 822155 .
- ↑ Shtengel G, Galbraith JA, Galbraith CG, et al. (marzo de 2009). "La microscopía de superresolución fluorescente interferométrica resuelve la ultraestructura celular 3D" . Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 106 (9): 3125–30 . Bibcode : 2009PNAS..106.3125S . doi : 10.1073/pnas.0813131106 . PMC 2637278. PMID 19202073 .
- ↑ Carlton PM (2008). "Microscopía de iluminación estructurada tridimensional y su aplicación a la estructura cromosómica" . Chromosome Res . 16 (3): 351– 65. doi : 10.1007/s10577-008-1231-9 . PMID 18461477 .
- ↑ Sibarita JB (2005). "Microscopía de deconvolución". Adv. Biochem. Eng. Biotechnol . Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95 : 201–43 . doi : 10.1007/b102215 . ISBN 978-3-540-23698-6. PMID 16080270 .
- ↑ Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., & Dodt, HU (2012). " Aclaramiento químico y deshidratación de cerebros de ratones que expresan GFP" . PLOS ONE . 7 (3) e33916. Bibcode : 2012PLoSO...733916B . doi : 10.1371/journal.pone.0033916 . PMC 3316521. PMID 22479475 .
{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace ) - ↑ Borisevich, AY; Lupini, AR; Pennycook, SJ (21 de febrero de 2006). "Sección en profundidad con el microscopio electrónico de transmisión de barrido con corrección de aberraciones" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 103 (9): 3044– 3048. Bibcode : 2006PNAS..103.3044B . doi : 10.1073/pnas.0507105103 . PMC 1413870. PMID 16492746 .
- ↑ Hovden, R; Ercius, P (2014). "Rompiendo el límite de Crowther: Combinando seccionamiento de profundidad y tomografía de inclinación para reconstrucciones 3D de campo amplio y alta resolución". Ultramicroscopy . 140 : 26–31 . arXiv : 1402.0028 . doi : 10.1016 /j.ultramic.2014.01.013 . PMID 24636875. S2CID 41919418 .
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