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Biblioteca genómica

Una biblioteca genómica es una colección de fragmentos de ADN superpuestos que, en conjunto, conforman el ADN genómico total de un organismo . El ADN se almacena en una població...

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Una biblioteca genómica es una colección de fragmentos de ADN superpuestos que, en conjunto, conforman el ADN genómico total de un organismo . El ADN se almacena en una población de vectores idénticos , cada uno con un inserto de ADN diferente. Para construir una biblioteca genómica, el ADN del organismo se extrae de las células y se digiere con una enzima de restricción para cortarlo en fragmentos de un tamaño específico. Estos fragmentos se insertan en el vector mediante la enzima ADN ligasa . [ 1 ] Posteriormente, el ADN del vector puede ser incorporado por un organismo huésped, generalmente una población de Escherichia coli o levadura , conteniendo cada célula una sola molécula del vector. El uso de una célula huésped para transportar el vector facilita la amplificación y recuperación de clones específicos de la biblioteca para su análisis. [ 2 ]

Existen varios tipos de vectores disponibles con diferentes capacidades de inserción. Generalmente, las bibliotecas creadas a partir de organismos con genomas más grandes requieren vectores con inserciones de mayor tamaño, por lo que se necesitan menos moléculas de vector para crear la biblioteca. Los investigadores también pueden elegir un vector considerando el tamaño de inserción ideal para encontrar el número deseado de clones necesarios para una cobertura completa del genoma. [ 3 ]

Las bibliotecas genómicas se utilizan comúnmente para aplicaciones de secuenciación . Han desempeñado un papel importante en la secuenciación del genoma completo de varios organismos, incluido el genoma humano y varios organismos modelo . [ 4 ] [ 5 ]

Historia

El primer genoma basado en ADN secuenciado completamente fue logrado por Frederick Sanger , dos veces ganador del Premio Nobel , en 1977. Sanger y su equipo de científicos crearon una biblioteca del bacteriófago phi X 174 para su uso en la secuenciación de ADN . [ 6 ] La importancia de este éxito contribuyó a la creciente demanda de secuenciación de genomas para la investigación de la terapia génica . Los equipos ahora pueden catalogar polimorfismos en los genomas e investigar aquellos genes candidatos que contribuyen a enfermedades como la enfermedad de Parkinson , la enfermedad de Alzheimer , la esclerosis múltiple , la artritis reumatoide y la diabetes tipo 1. [ 7 ] Esto se debe al avance de los estudios de asociación de genoma completo gracias a la capacidad de crear y secuenciar bibliotecas genómicas. Anteriormente, los estudios de ligamiento y de genes candidatos eran algunos de los únicos enfoques. [ 8 ]

Construcción de bibliotecas genómicas

La construcción de una biblioteca genómica implica la creación de numerosas moléculas de ADN recombinante . El ADN genómico de un organismo se extrae y se digiere con una enzima de restricción . Para organismos con genomas muy pequeños (~10 kb) , los fragmentos digeridos se pueden separar mediante electroforesis en gel . Posteriormente, los fragmentos separados se pueden escindir y clonar individualmente en el vector. Sin embargo, cuando se digiere un genoma grande con una enzima de restricción, la cantidad de fragmentos es demasiado grande para escindirlos individualmente. El conjunto completo de fragmentos debe clonarse junto con el vector, y la separación de los clones puede realizarse posteriormente. En ambos casos, los fragmentos se ligan a un vector que ha sido digerido con la misma enzima de restricción. El vector que contiene los fragmentos de ADN genómico insertados se puede introducir en un organismo huésped. [ 1 ]

A continuación se detallan los pasos para crear una biblioteca genómica a partir de un genoma grande.

  1. Extraer y purificar el ADN.
  2. Digiere el ADN con una enzima de restricción. Esto crea fragmentos de tamaño similar, cada uno de los cuales contiene uno o más genes.
  3. Inserta los fragmentos de ADN en vectores previamente cortados con la misma enzima de restricción. Utiliza la enzima ADN ligasa para sellar los fragmentos de ADN dentro del vector. Esto crea una gran cantidad de moléculas recombinantes.
  4. Estas moléculas recombinantes son absorbidas por una bacteria huésped mediante transformación , creando una biblioteca de ADN. [ 9 ] [ 10 ]

A continuación se muestra un diagrama de los pasos descritos anteriormente.

Construcción de bibliotecas genómicas

Determinación del título de la biblioteca

Una vez construida una biblioteca genómica con un vector viral, como el fago lambda , se puede determinar el título de la biblioteca. El cálculo del título permite a los investigadores estimar la cantidad de partículas virales infecciosas que se crearon con éxito en la biblioteca. Para ello, se utilizan diluciones de la biblioteca para transformar cultivos de E. coli de concentraciones conocidas. A continuación, los cultivos se siembran en placas de agar y se incuban durante la noche. Se cuenta el número de placas virales , que se utiliza para calcular el número total de partículas virales infecciosas en la biblioteca. La mayoría de los vectores virales también llevan un marcador que permite distinguir los clones que contienen un inserto de aquellos que no lo tienen. Esto permite a los investigadores determinar también el porcentaje de partículas virales infecciosas que portan un fragmento de la biblioteca. [ 11 ]

Se puede utilizar un método similar para titular bibliotecas genómicas creadas con vectores no virales, como plásmidos y BACs . Se puede realizar una ligación de prueba de la biblioteca para transformar E. coli. La transformación se siembra en placas de agar y se incuba durante la noche. El título de la transformación se determina contando el número de colonias presentes en las placas. Estos vectores generalmente poseen un marcador seleccionable que permite diferenciar los clones que contienen un inserto de aquellos que no lo contienen. Al realizar esta prueba, los investigadores también pueden determinar la eficiencia de la ligación y realizar los ajustes necesarios para asegurar la obtención del número deseado de clones para la biblioteca. [ 12 ]

Biblioteca de proyecciones

Hibridación por transferencia de colonias

Para aislar clones que contengan regiones de interés de una biblioteca, primero se debe realizar un cribado de la misma . Un método de cribado es la hibridación . Cada célula huésped transformada de una biblioteca contendrá un único vector con un único fragmento de ADN. La biblioteca completa se puede sembrar en un filtro sobre un medio de cultivo . El filtro y las colonias se preparan para la hibridación y luego se marcan con una sonda . [ 13 ] El fragmento de ADN diana (el fragmento de interés) se puede identificar mediante detección, como la autorradiografía, debido a la hibridación con la sonda, como se muestra a continuación.

Otro método de cribado es mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Algunas bibliotecas se almacenan como grupos de clones y el cribado por PCR es una forma eficiente de identificar grupos que contienen clones específicos. [ 2 ]

Tipos de vectores

El tamaño del genoma varía entre los diferentes organismos, por lo que el vector de clonación debe seleccionarse en consecuencia. Para un genoma grande, se debe elegir un vector de gran capacidad, de modo que un número relativamente pequeño de clones sea suficiente para cubrir todo el genoma. Sin embargo, a menudo resulta más difícil caracterizar un inserto contenido en un vector de mayor capacidad. [ 3 ]

A continuación se muestra una tabla con varios tipos de vectores que se utilizan habitualmente para bibliotecas genómicas y el tamaño de inserción que suele contener cada uno.

Plásmidos

Un plásmido es una molécula de ADN circular de doble cadena comúnmente utilizada para la clonación molecular . Los plásmidos suelen tener una longitud de 2 a 4 kilobases (kb) y pueden contener inserciones de hasta 15 kb. Los plásmidos contienen un origen de replicación que les permite replicarse dentro de una bacteria independientemente del cromosoma del huésped . Comúnmente, los plásmidos portan un gen de resistencia a antibióticos que permite seleccionar las células bacterianas que contienen el plásmido. Muchos plásmidos también portan un gen reportero que permite a los investigadores distinguir los clones que contienen una inserción de aquellos que no la contienen. [ 3 ]

Fago lambda (λ)

El fago λ es un virus de ADN de doble cadena que infecta a E. coli . El cromosoma λ tiene una longitud de 48,5 kb y puede contener inserciones de hasta 25 kb. Estas inserciones reemplazan secuencias virales no esenciales en el cromosoma λ, mientras que los genes necesarios para la formación de partículas virales y la infección permanecen intactos. El ADN insertado se replica junto con el ADN viral; de esta forma, se empaquetan juntos en partículas virales. Estas partículas son muy eficientes en la infección y la multiplicación, lo que da lugar a una mayor producción de cromosomas λ recombinantes. [ 3 ] Sin embargo, debido al menor tamaño de la inserción, las bibliotecas creadas con el fago λ pueden requerir muchos clones para una cobertura genómica completa. [ 14 ]

Cósmidos

Los vectores cósmidos son plásmidos que contienen una pequeña región del ADN del bacteriófago λ denominada secuencia cos. Esta secuencia permite que el cósmido se empaquete en partículas del bacteriófago λ. Estas partículas, que contienen un cósmido linealizado, se introducen en la célula huésped mediante transducción . Una vez dentro del huésped, los cósmidos se circularizan con la ayuda de la ADN ligasa del huésped y funcionan como plásmidos. Los cósmidos pueden transportar fragmentos de hasta 40 kb. [ 2 ]

Vectores del bacteriófago P1

Los vectores del bacteriófago P1 pueden contener insertos de 70 a 100 kb. Comienzan como moléculas de ADN lineal empaquetadas en partículas del bacteriófago P1. Estas partículas se inyectan en una cepa de E. coli que expresa la recombinasa Cre . El vector P1 lineal se circulariza mediante recombinación entre dos sitios loxP en el vector. Los vectores P1 generalmente contienen un gen de resistencia a antibióticos y un marcador de selección positiva para distinguir los clones que contienen un inserto de los que no. Los vectores P1 también contienen un replicón de plásmido P1 , que garantiza que solo haya una copia del vector en la célula. Sin embargo, existe un segundo replicón P1, llamado replicón lítico P1, que está controlado por un promotor inducible . Este promotor permite la amplificación de más de una copia del vector por célula antes de la extracción de ADN . [ 2 ]

vector bac

cromosomas artificiales P1

Los cromosomas artificiales P1 (PAC) poseen características tanto de los vectores P1 como de los cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Al igual que los vectores P1, contienen un plásmido y un replicón lítico, como se describió anteriormente. A diferencia de los vectores P1, no necesitan ser empaquetados en partículas de bacteriófago para la transducción. En cambio, se introducen en E. coli como moléculas de ADN circular mediante electroporación , al igual que los BAC. [ 2 ] También al igual que los BAC, su preparación es relativamente más compleja debido a que poseen un único origen de replicación. [ 14 ]

Cromosomas artificiales bacterianos

Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son moléculas de ADN circular, generalmente de unos 7 kb de longitud, capaces de albergar inserciones de hasta 300 kb. Los vectores BAC contienen un replicón derivado del factor F de E. coli , lo que garantiza que se mantengan en una copia por célula. [ 4 ] Una vez que una inserción se liga a un BAC, este se introduce en cepas de E. coli deficientes en recombinación mediante electroporación. La mayoría de los vectores BAC contienen un gen de resistencia a antibióticos y también un marcador de selección positiva. [ 2 ] La figura de la derecha muestra un vector BAC siendo cortado con una enzima de restricción, seguido de la inserción de ADN extraño que se vuelve a unir mediante una ligasa. En general, se trata de un vector muy estable, pero su preparación puede ser compleja debido a que posee un único origen de replicación, al igual que los PAC. [ 14 ]

cromosomas artificiales de levadura

Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son moléculas de ADN lineal que contienen las características necesarias de un cromosoma de levadura auténtico, incluyendo telómeros , un centrómero y un origen de replicación . Se pueden ligar grandes fragmentos de ADN en el centro del YAC, de modo que haya un "brazo" del YAC a cada lado del fragmento. El YAC recombinante se introduce en la levadura mediante transformación; los marcadores seleccionables presentes en el YAC permiten identificar los transformantes exitosos. Los YAC pueden contener fragmentos de hasta 2000 kb, pero la mayoría de las bibliotecas de YAC contienen fragmentos de entre 250 y 400 kb. Teóricamente, no existe un límite superior para el tamaño del fragmento que puede contener un YAC. Es la calidad de la preparación del ADN utilizado para los fragmentos lo que determina el límite de tamaño. [ 2 ] El aspecto más desafiante del uso de YAC es su propensión a la reorganización . [ 14 ]

Cómo seleccionar un vector

La selección de vectores requiere asegurar que la biblioteca creada sea representativa de todo el genoma. Cualquier inserto del genoma derivado de una enzima de restricción debe tener la misma probabilidad de estar en la biblioteca que cualquier otro inserto. Además, las moléculas recombinantes deben contener insertos lo suficientemente grandes para garantizar que el tamaño de la biblioteca se pueda manejar convenientemente. [ 14 ] Esto está determinado particularmente por la cantidad de clones necesarios en una biblioteca. La cantidad de clones para obtener una muestra de todos los genes está determinada por el tamaño del genoma del organismo, así como por el tamaño promedio del inserto. Esto se representa mediante la fórmula (también conocida como fórmula de Carbon y Clarke): [ 15 ]

norte=lnorte(1−PAG)lnorte(1−F){\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-f)}}}

dónde,

norte{\displaystyle N}es el número necesario de recombinantes [ 16 ]

PAG{\displaystyle P}es la probabilidad deseada de que cualquier fragmento del genoma aparezca al menos una vez en la biblioteca creada

F{\displaystyle f}es la proporción fraccional del genoma en un solo recombinante

F{\displaystyle f}Se puede demostrar además que:

F=igramo{\displaystyle f={\frac {i}{g}}}

dónde,

i{\displaystyle i}es el tamaño del inserto

gramo{\displaystyle g}es el tamaño del genoma

Por lo tanto, aumentar el tamaño del inserto (mediante la elección del vector) permitiría necesitar menos clones para representar un genoma. La proporción entre el tamaño del inserto y el tamaño del genoma representa la proporción del genoma respectivo en un solo clon. [ 14 ] Aquí está la ecuación con todas las partes consideradas:

norte=lnorte(1−PAG)lnorte(1−igramo){\displaystyle N={\frac {ln(1-P)}{ln(1-{\frac {i}{g}})}}}

Ejemplo de selección vectorial

La fórmula anterior permite determinar un nivel de confianza del 99 % de que todas las secuencias de un genoma están representadas mediante un vector con un tamaño de inserción de veinte mil pares de bases (como el vector del fago lambda). En este ejemplo, el tamaño del genoma del organismo es de tres mil millones de pares de bases.

norte=lnorte(1−0,99)lnorte[1−2.0×104basmipagairs3.0×109basmipagairs]{\displaystyle N={\frac {ln(1-0.99)}{ln[1-{\frac {2.0\times 10^{4}basepairs}{3.0\times 10^{9}basepairs}}]}}}

norte=−4.61−6.7×10−6{\displaystyle N={\frac {-4.61}{-6.7\times 10^{-6}}}}

norte=688,060{\displaystyle N=688,060}clones

Por lo tanto, se requieren aproximadamente 688.060 clones para garantizar una probabilidad del 99% de que una secuencia de ADN determinada de este genoma de tres mil millones de pares de bases esté presente en una biblioteca que utilice un vector con un tamaño de inserción de veinte mil pares de bases.

Aplicaciones

Una vez creada una biblioteca, el genoma de un organismo puede secuenciarse para dilucidar cómo los genes lo afectan o para comparar organismos similares a nivel genómico. Los estudios de asociación de genoma completo mencionados anteriormente pueden identificar genes candidatos derivados de muchos rasgos funcionales. Los genes pueden aislarse mediante bibliotecas genómicas y utilizarse en líneas celulares humanas o modelos animales para continuar la investigación. [ 17 ] Además, la creación de clones de alta fidelidad con una representación genómica precisa y sin problemas de estabilidad contribuiría significativamente como intermediarios para la secuenciación de escopeta o el estudio de genes completos en el análisis funcional. [ 10 ]

Secuenciación jerárquica

Secuenciación de genoma completo mediante el método de escopeta frente a secuenciación jerárquica mediante el método de escopeta.

Una de las principales aplicaciones de las bibliotecas genómicas es la secuenciación jerárquica de escopeta , también conocida como secuenciación descendente, basada en mapas o clon por clon. Esta estrategia se desarrolló en la década de 1980 para secuenciar genomas completos antes de que estuvieran disponibles las técnicas de secuenciación de alto rendimiento. Los clones individuales de las bibliotecas genómicas se pueden dividir en fragmentos más pequeños, generalmente de 500 pb a 1000 pb, que son más manejables para la secuenciación. [ 4 ] Una vez secuenciado un clon de una biblioteca genómica, la secuencia se puede utilizar para buscar en la biblioteca otros clones que contengan inserciones que se solapen con el clon secuenciado. Cualquier clon nuevo que se solape se puede secuenciar formando un contig . Esta técnica, denominada " recorrido cromosómico ", se puede utilizar para secuenciar cromosomas completos. [ 2 ]

La secuenciación de genoma completo mediante el método de escopeta es otro método de secuenciación genómica que no requiere una biblioteca de vectores de alta capacidad. En cambio, utiliza algoritmos informáticos para ensamblar lecturas de secuencia cortas que cubren todo el genoma. Por esta razón, las bibliotecas genómicas se utilizan a menudo en combinación con la secuenciación de genoma completo mediante el método de escopeta. Se puede crear un mapa de alta resolución secuenciando ambos extremos de los insertos de varios clones en una biblioteca genómica. Este mapa proporciona secuencias con distancias conocidas entre sí, que pueden utilizarse para ayudar en el ensamblaje de las lecturas de secuencia adquiridas mediante la secuenciación de escopeta. [ 4 ] La secuencia del genoma humano, que se declaró completa en 2003, se ensambló utilizando tanto una biblioteca BAC como la secuenciación de escopeta. [ 18 ] [ 19 ]

Estudios de asociación de todo el genoma

Los estudios de asociación de genoma completo son aplicaciones generales para encontrar genes diana y polimorfismos específicos dentro de la raza humana. De hecho, el proyecto internacional HapMap se creó mediante una colaboración de científicos y agencias de varios países para catalogar y utilizar estos datos. [ 20 ] El objetivo de este proyecto es comparar secuencias genéticas de diferentes individuos para dilucidar similitudes y diferencias dentro de las regiones cromosómicas. [ 20 ] Científicos de todas las naciones participantes están catalogando estos atributos con datos de poblaciones de ascendencia africana, asiática y europea. Estas evaluaciones de genoma completo pueden conducir a más terapias de diagnóstico y farmacológicas, además de ayudar a futuros equipos a centrarse en orquestar terapias teniendo en cuenta las características genéticas. Estos conceptos ya se están explotando en la ingeniería genética . [ 20 ] Por ejemplo, un equipo de investigación ha construido un vector lanzadera PAC que crea una biblioteca que representa una cobertura doble del genoma humano. [ 17 ] Esto podría servir como un recurso increíble para identificar genes, o conjuntos de genes, que causan enfermedades. Además, estos estudios pueden servir como una poderosa herramienta para investigar la regulación transcripcional, como se ha observado en el estudio de los baculovirus. [ 21 ] En general, los avances en la construcción de bibliotecas genómicas y la secuenciación de ADN han permitido el descubrimiento eficiente de diferentes dianas moleculares. [ 5 ] La asimilación de estas características mediante métodos tan eficientes puede acelerar el desarrollo de nuevos fármacos candidatos.

Referencias

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  3. 1 2 3 4 Hartwell, Leland (2008). Genética: de los genes a los genomas . Boston: McGraw-Hill Higher Education. ISBN 978-0-07-284846-5.
  4. 1 2 3 4 Muse, Spencer V.; Gibson, Greg (2004). Introducción a la ciencia del genoma . Sunderland, Mass: Sinauer Associates. ISBN 978-0-87893-232-0.
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  7. ↑ Menon R, Farina C (2011). "Marcos moleculares y funcionales compartidos entre cinco trastornos humanos complejos: un estudio comparativo sobre interactomas vinculados a genes de susceptibilidad" . PLOS ONE . 6 (4) e18660. Bibcode : 2011PLoSO...618660M . doi : 10.1371/journal.pone.0018660 . PMC 3080867. PMID 21533026 .  
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Lecturas adicionales

Klug, Cummings, Spencer, Palladino (2010). Fundamentos de genética . Pearson. págs. 355–264 . ISBN  978-0-321-61869-6.{{cite book}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )

  • Construcción de bibliotecas BAC genómicas