Vector de clonación

Todos los vectores de clonación poseen características que permiten insertar o extraer genes fácilmente. Estas características pueden ser un sitio de clonación múltiple (MCS) o un polienlazador, que contiene numerosos sitios de restricción únicos . Los sitios de restricción del MCS se escinden primero mediante enzimas de restricción; posteriormente, un gen diana amplificado por PCR y digerido con las mismas enzimas se liga al vector mediante ADN ligasa . La secuencia de ADN diana puede insertarse en el vector en una dirección específica si se desea. Los sitios de restricción pueden utilizarse además para la subclonación en otro vector, si fuera necesario.

Otros vectores de clonación pueden usar topoisomerasa en lugar de ligasa y la clonación puede hacerse más rápidamente sin necesidad de digestión con enzimas de restricción del vector o inserto. En este método de clonación TOPO, un vector linealizado se activa uniendo topoisomerasa I a sus extremos, y este vector "activado por TOPO" puede entonces aceptar un producto de PCR ligando ambos extremos 5' del producto de PCR, liberando la topoisomerasa y formando un vector circular en el proceso. ^{[ 2 ]} Otro método de clonación sin el uso de digestión de ADN y ligasa es por recombinación de ADN , por ejemplo, como se usa en el sistema de clonación Gateway y el ensamblaje de Gibson . ^{[ 3 ] [ 4 ]} El gen, una vez clonado en el vector de clonación (llamado clon de entrada en este método), puede introducirse convenientemente en una variedad de vectores de expresión por recombinación. ^{[ 5 ]}

Un marcador seleccionable es transportado por el vector para permitir la selección de células transformadas positivamente. La resistencia a antibióticos se usa frecuentemente como marcador, por ejemplo, el gen de la betalactamasa , que confiere resistencia al grupo de antibióticos betalactámicos de la penicilina , como la ampicilina, u otras clases de antibióticos, como la tetraciclina , la kanamicina A o el cloranfenicol . ^{[ 6 ]} Algunos vectores contienen dos marcadores seleccionables; por ejemplo, el plásmido pACYC177 tiene genes de resistencia tanto a la ampicilina como a la kanamicina . ^{[ 7 ]} Los vectores lanzadera, diseñados para mantenerse en dos organismos diferentes, también pueden requerir dos marcadores seleccionables, aunque algunos marcadores seleccionables, como la resistencia a la zeocina y la higromicina B, son efectivos en diferentes tipos de células. También se pueden usar marcadores de selección auxótrofa que permiten que un organismo auxótrofo crezca en un medio de cultivo mínimo ; ejemplos de estos son LEU2 y URA3 , que se usan con sus cepas auxótrofas de levadura correspondientes. ^{[ 8 ]}

Otro tipo de marcador seleccionable permite la selección positiva de plásmidos con genes clonados. Esto puede implicar el uso de un gen letal para las células huésped, como barnasa , ^{[ 9 ]} Ccda , ^{[ 10 ]} y las toxinas parD/parE . ^{[ 11 ] [ 12 ]} Esto generalmente funciona interrumpiendo o eliminando el gen letal durante el proceso de clonación, y los clones fallidos donde el gen letal aún permanece intacto matarían a las células huésped, por lo que solo se seleccionan los clones exitosos.

En algunos vectores de clonación se utilizan genes reporteros para facilitar la selección de clones exitosos mediante características que permiten identificarlos fácilmente. Estas características pueden ser el fragmento lacZ α para la complementación α en la selección azul-blanco , o genes marcadores o reporteros en fase con el MCS y flanqueándolo para facilitar la producción de proteínas de fusión . Ejemplos de proteínas de fusión que se pueden usar para la selección son la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa .

Un vector de clonación no necesita contener elementos adecuados para la expresión de un gen diana clonado, como un promotor y un sitio de unión ribosómica (RBS); sin embargo, muchos sí los contienen y pueden funcionar como vectores de expresión . El ADN diana puede insertarse en un sitio controlado por un promotor específico necesario para la expresión del gen diana en el huésped elegido. Cuando el promotor está presente, la expresión del gen se controla de forma precisa y es inducible , de modo que las proteínas solo se producen cuando se requieren. Algunos promotores de uso común son los promotores T7 y lac . La presencia de un promotor es necesaria cuando se utilizan técnicas de selección como la selección azul-blanco .

En ocasiones, se utilizan vectores de clonación sin promotor ni sitio de unión al ribosoma (RBS) para la secuencia de ADN clonada, por ejemplo, al clonar genes cuyos productos son tóxicos para las células de E. coli . El promotor y el RBS para la secuencia de ADN clonada tampoco son necesarios al crear una biblioteca genómica o de ADNc de clones, ya que los genes clonados normalmente se subclonan en un vector de expresión más adecuado si se requiere su expresión.

Algunos vectores están diseñados únicamente para la transcripción, sin la expresión de proteínas heterólogas; por ejemplo, para la producción de ARNm in vitro . Estos vectores se denominan vectores de transcripción. Pueden carecer de las secuencias necesarias para la poliadenilación y la terminación, por lo que no pueden utilizarse para la producción de proteínas.

Los plásmidos son ADN extracromosómico circular que se replica de forma autónoma. Son los vectores de clonación estándar y los más utilizados. La mayoría de los plásmidos generales pueden utilizarse para clonar fragmentos de ADN de hasta 15 kb. Uno de los primeros vectores de clonación de uso común es el plásmido pBR322 . Otros vectores de clonación incluyen la serie de plásmidos pUC , y existe una gran variedad de vectores de plásmidos de clonación disponibles. Muchos plásmidos tienen un número elevado de copias; por ejemplo, pUC19 tiene entre 500 y 700 copias por célula ^{[ 7 ].} Este número elevado de copias resulta útil, ya que produce un mayor rendimiento de plásmido recombinante para su posterior manipulación. Sin embargo, en ciertas circunstancias, se pueden utilizar plásmidos con un número bajo de copias, por ejemplo, cuando la proteína del gen clonado es tóxica para las células ^{[ 13 ] .}

Algunos plásmidos contienen un origen de replicación del bacteriófago M13 y pueden utilizarse para generar ADN monocatenario. Estos se denominan fagemidos , y un ejemplo de ello son los vectores de clonación de la serie pBluescript .

Debido a que los vectores de clonación basados ​​en plásmidos se han adoptado ampliamente en biología molecular, se conservan ejemplos bien caracterizados como materiales de referencia en centros públicos de recursos biológicos y repositorios sin ánimo de lucro, lo que facilita la reproducibilidad en la investigación; entre estos repositorios se incluyen Addgene y colecciones públicas como BCCM/GeneCorner.

Los bacteriófagos utilizados para la clonación son el fago λ y el fago M13 . ^{[ 14 ]} Existe un límite superior en la cantidad de ADN que se puede empaquetar en un fago (un máximo de 53 kb), por lo que para permitir la inserción de ADN extraño en el ADN del fago, los vectores de clonación de fagos pueden necesitar la eliminación de algunos genes no esenciales, por ejemplo, los genes de la lisogenia , ya que el uso del fago λ como vector de clonación solo implica el ciclo lítico. ^{[ 15 ]} Existen dos tipos de vectores de fago λ: vector de inserción y vector de reemplazo. Los vectores de inserción contienen un sitio de corte único mediante el cual se puede insertar ADN extraño de 5 a 11 kb. En los vectores de reemplazo, los sitios de corte flanquean una región que contiene genes no esenciales para el ciclo lítico, y esta región puede eliminarse y reemplazarse por el ADN insertado en el proceso de clonación, y se puede insertar un ADN de mayor tamaño de 8 a 24 kb. ^{[ 7 ]}

También existe un límite de tamaño mínimo para el ADN que se puede empaquetar en un fago, y el ADN del vector que es demasiado pequeño no se puede empaquetar correctamente en el fago. Esta propiedad se puede utilizar para la selección: un vector sin inserto puede ser demasiado pequeño, por lo que solo se pueden seleccionar vectores con inserto para su propagación. ^{[ 16 ]}

Los cósmidos son plásmidos que incorporan un segmento de ADN del bacteriófago λ que posee el sitio de extremo cohesivo ( cos ), el cual contiene los elementos necesarios para el empaquetamiento del ADN en partículas λ. Bajo un origen de replicación (ori) adecuado, puede replicarse como un plásmido. Normalmente se utiliza para clonar fragmentos de ADN grandes, de entre 28 y 45 kb. ^{[ 7 ]}

Se pueden clonar fragmentos de hasta 350 kb en cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Los BAC se mantienen en E. coli con un número de copias de solo 1 por célula. ^{[ 7 ]} Los BAC se basan en el plásmido F , otro cromosoma artificial llamado PAC se basa en el fago P1 .

Los cromosomas artificiales de levadura se utilizan como vectores para clonar fragmentos de ADN de más de 1 megabase (1 Mb = 1000 kb). Son útiles para clonar fragmentos de ADN de mayor tamaño, necesarios para el mapeo de genomas, como en el Proyecto Genoma Humano . Contienen una secuencia telomérica, una secuencia de replicación autónoma (características necesarias para replicar cromosomas lineales en células de levadura). Estos vectores también contienen sitios de restricción adecuados para clonar ADN extraño, así como genes que se utilizan como marcadores de selección.

El cromosoma artificial humano podría ser útil como vector de transferencia génica para la introducción de genes en células humanas, así como herramienta para estudios de expresión y para determinar la función de los cromosomas humanos. Puede transportar fragmentos de ADN muy grandes (sin límite superior de tamaño para fines prácticos), por lo que no presenta el problema de la capacidad de clonación limitada de otros vectores, y además evita la posible mutagénesis por inserción causada por la integración en los cromosomas del huésped mediante un vector viral. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

Los virus que infectan células vegetales y animales también se han manipulado para introducir genes extraños en ellas. La capacidad natural de los virus para adsorberse a las células, introducir su ADN y replicarse los ha convertido en vehículos ideales para transferir ADN extraño a células eucariotas en cultivo. Un vector basado en el virus simio 40 (SV40) se utilizó en el primer experimento de clonación con células de mamíferos. Se han utilizado varios vectores basados ​​en otros tipos de virus, como adenovirus y virus del papiloma, para clonar genes en mamíferos. Actualmente, los vectores retrovirales son populares para la clonación de genes en células de mamíferos. En el caso de las plantas, se han utilizado virus como el virus del mosaico de la coliflor , el virus del mosaico del tabaco y los virus gemini , con un éxito limitado.