Hibridación de colonias

La hibridación de colonias es un método para seleccionar colonias bacterianas con genes deseados mediante un proceso sencillo de clonación y transferencia. ^{[ 1 ]} Los genes de interés se han añadido previamente a un plásmido bacteriano mediante recombinación , lo que permite analizar genes de otros organismos dentro de una colonia bacteriana. El proceso general implica la transferencia de material genético de un medio a otro, generalmente utilizando papel de filtro de nitrocelulosa, con el objetivo de identificar y aislar un gen específico. Se utiliza ARN radiografiado para encontrar la secuencia deseada dentro de la nueva colonia bacteriana y, esencialmente, "iluminarla" para que la secuencia pueda identificarse para su transferencia. El propósito más común de la hibridación de colonias es verificar que una determinada secuencia de ADN haya podido entrar con éxito en una nueva célula, lo que significa que las células analizadas mediante este método son el resultado de la recombinación entre un fragmento específico de ADN y un plásmido bacteriano. ^{[ 2 ]} Este método fue descubierto por Michael Grunstein y David S. Hogness . ^{[ 3 ]}

La hibridación de colonias comienza con el deseo de extraer un segmento de ADN que contenga un gen específico, como un gen que confiere resistencia a los antibióticos. ^{[ 4 ]} Se extrae un fragmento específico de ADN de su cultivo celular correspondiente y se inserta en un plásmido bacteriano mediante un proceso conocido como recombinación. Estos plásmidos bacterianos se cultivan en una placa de agar nutritivo , lo que da lugar a la formación de colonias bacterianas, algunas de las cuales idealmente continúan conteniendo el gen de interés. A continuación, se lava un filtro de nitrocelulosa tres veces con agua destilada, se coloca entre láminas absorbentes y se calienta a altas temperaturas para eliminar bacterias u otros microorganismos. Este filtro, que tiene un tamaño de poro de 0,45 μm, se somete a estos procesos para garantizar que no haya contaminación durante la transferencia, lo que permite obtener resultados precisos. Las colonias bacterianas se replican simétricamente en el filtro de nitrocelulosa por contacto directo. En este punto, las células en la membrana del filtro se lisan para abrir los plásmidos y facilitar el acceso, y su ADN se desnaturaliza, lo que permite que se una al filtro. ^{[ 2 ]} Estos grupos de ADN se hibridan con una sonda de ARN o ADN marcada radiactivamente y se analizan mediante autorradiografía . La sonda de ARN (o ADN) se seleccionó previamente en función del ADN que contiene el gen deseado, ya que debe contener la cadena complementaria que le permita unirse con precisión al material genético correcto. Mediante el uso de la sonda radiactiva, se identifican los grupos que presentan el gen deseado para su uso en investigaciones posteriores. Con frecuencia, se comparan con las colonias bacterianas (vivas) correspondientes, que no han sido sometidas al procedimiento de lisis celular, las cuales también pueden aislarse para su posterior cultivo y experimentación. ^{[ 3 ]}

El descubrimiento inicial de esta técnica utilizó segmentos de ADN de Drosophila melanogaster como material genético, el cual se insertó en un plásmido de E. coli . El propósito, como se describe en la publicación de 1975 de Michael Grunstein y David S. Hogness, hace referencia a la incapacidad previa de aislar una secuencia específica deseada de una célula hibridada, lo que los impulsó a tomar medidas para que esto fuera posible. ^{[ 3 ]} Llegaron a la conclusión de que la técnica que habían desarrollado, que se denominaría hibridación de colonias, era adecuada para el aislamiento de cualquier segmento de ADN siempre que se dispusiera del ARN complementario correcto para identificar la secuencia seleccionada.

Varios años después, en 1978, Brigitte Cami y Philippe Kourilsky realizaron nuevos experimentos para aumentar la eficiencia de la hibridación de colonias, específicamente incrementando el número de colonias bacterianas por placa. El procedimiento que desarrollaron utilizó un profago que se induce térmicamente para lisar todas las células de la placa. Mediante esta técnica, Cami y Kourilsky aceleraron el proceso de hibridación de colonias y evitaron la necesidad de hibridar cada colonia individualmente, como ocurría en los primeros procedimientos. ^{[ 5 ]}

Existen innumerables usos para las técnicas de hibridación de colonias, pero algunas publicaciones recientes destacan su aplicación de maneras no convencionales. En 2006, el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Columbia Británica publicó un artículo que detallaba el uso de la hibridación de colonias como método de tratamiento de aguas residuales. El objetivo del procedimiento experimental era determinar si este proceso era adecuado para la detección precisa de muestras de ADN específicas en aguas residuales, dado el gran número de colonias que se pueden analizar simultáneamente. ^{[ 6 ]} También se han utilizado diversas técnicas de hibridación de ADN en el análisis de enfermedades infecciosas. N. gonorrhoeae y C. trachomatis son dos enfermedades bien conocidas cuyo análisis mediante técnicas de hibridación de colonias ha sido recomendado por organizaciones nacionales de salud, incluidos los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) . Estos son solo algunos ejemplos específicos que ilustran cómo se puede utilizar la hibridación de colonias en diferentes campos científicos y para diversos fines. ^{[ 4 ]}