Citotoxicidad dependiente del complemento

El desarrollo de anticuerpos terapéuticos antitumorales implica el análisis in vitro de sus funciones efectoras, incluyendo la capacidad de desencadenar la CDC para eliminar las células diana. El enfoque clásico consiste en incubar los anticuerpos con las células diana y una fuente de complemento ( suero ). Posteriormente, se determina la muerte celular mediante diversos métodos:

• Método radiactivo: las células diana se marcan con ^51Cr antes del ensayo CDC, el cromo se libera durante la lisis celular y se mide la cantidad de radiactividad . ^{[ 6 ] [ 7 ]}
• Medición de la actividad metabólica de células vivas (tinción de células vivas): tras la incubación de las células diana con anticuerpos y complemento, se añade un colorante permeable a la membrana plasmática (p. ej., calceína -AM ^{[ 7 ] [ 8 ]} o resazurina ^{[ 6 ] [ 9 ]} ). Las células vivas lo metabolizan en un producto fluorescente impermeable que puede detectarse mediante citometría de flujo . Este producto no puede formarse en células muertas metabólicamente inactivas.
• Medición de la actividad de las enzimas intracelulares liberadas: las células muertas liberan enzimas (por ejemplo , LDH o GAPDH ) ^{[ 6 ]} y la adición de su sustrato conduce a un cambio de color, que generalmente se cuantifica como un cambio de absorbancia o luminiscencia .
• Tinción de células muertas: un colorante (fluorescente) penetra en las células muertas a través de su membrana plasmática dañada. Por ejemplo, el yoduro de propidio se une al ADN de las células muertas y la señal fluorescente se mide mediante citometría de flujo. ^{[ 6 ]}

Los ensayos de los CDC se utilizan para encontrar un donante adecuado para el trasplante de órganos o médula ósea , es decir, un donante con un fenotipo compatible del sistema de histocompatibilidad HLA . ^{[ 10 ]} En primer lugar, se realiza la tipificación HLA del paciente y del donante para determinar sus fenotipos HLA. Cuando se encuentra una pareja potencialmente adecuada, se realiza una prueba de compatibilidad cruzada para excluir que el paciente produzca anticuerpos anti-HLA específicos del donante, que podrían causar el rechazo del injerto .

La tipificación HLA del CDC (también conocida como tipificación serológica) utiliza un lote de anticuerpos anti-HLA provenientes de antisueros alogénicos o anticuerpos monoclonales caracterizados . Estos anticuerpos se incuban individualmente con los linfocitos del paciente o del donante y una fuente de complemento. La cantidad de células muertas (y, por lo tanto, el resultado positivo) se mide mediante tinción de células vivas o muertas. Actualmente, la tipificación del CDC está siendo reemplazada por la tipificación molecular, que permite identificar las secuencias de nucleótidos de las moléculas HLA mediante PCR . ^{[ 10 ]}

El ensayo CDC se utiliza habitualmente para realizar la prueba de compatibilidad cruzada. La versión básica consiste en la incubación del suero del paciente con los linfocitos del donante y una segunda incubación tras la adición de complemento de conejo. La presencia de células muertas (prueba positiva) indica que el donante no es compatible con este paciente en particular. Existen modificaciones disponibles para aumentar la sensibilidad de la prueba, como la prolongación del tiempo mínimo de incubación, la adición de antiglobulina humana (AHG), la eliminación de anticuerpos no unidos antes de añadir el complemento y la separación de las subpoblaciones de linfocitos T y B. Además de la prueba de compatibilidad cruzada CDC, también está disponible la prueba de compatibilidad cruzada por citometría de flujo, que es más sensible y puede detectar incluso anticuerpos no activadores del complemento. ^{[ 11 ]}