Análisis de la cuna

El análisis C0t , una técnica basada en los principios de la _cinética de reasociación del ADN , es una técnica bioquímica que mide la cantidad de ADN repetitivo en una muestra de ADN, como un genoma . ^{[ 1 ]} Se utiliza para estudiar la estructura y organización del genoma y también se ha empleado para simplificar la secuenciación de genomas que contienen grandes cantidades de secuencias repetitivas. ^{[ 2 ]}

El procedimiento consiste en calentar una muestra de ADN genómico hasta que se desnaturalice y se convierta en una cadena sencilla, para luego enfriarla lentamente y permitir que las cadenas se vuelvan a emparejar. Mientras la muestra se enfría, se mide la cantidad de ADN que permanece emparejado a cada temperatura.

La cantidad de ADN monocatenario y bicatenario se mide diluyendo rápidamente la muestra, lo que ralentiza la reasociación, y luego uniendo el ADN a una columna de hidroxiapatita . La columna se lava primero con una baja concentración de tampón de fosfato de sodio , que eluye el ADN monocatenario, y luego con altas concentraciones de fosfato, que eluye el ADN bicatenario. La cantidad de ADN en estas dos soluciones se mide posteriormente con un espectrofotómetro .

Dado que una secuencia de ADN monocatenario necesita encontrar su cadena complementaria para reformar una doble hélice, las secuencias comunes se renaturalizan más rápidamente que las raras. De hecho, la velocidad a la que una secuencia se reasocia es proporcional al número de copias de dicha secuencia en la muestra de ADN. Una muestra con una secuencia altamente repetitiva se renaturalizará rápidamente, mientras que las secuencias complejas se renaturalizarán lentamente.

Sin embargo, en lugar de simplemente medir el porcentaje de ADN de doble cadena en función del tiempo, la cantidad de renaturalización se mide en relación con un valor _C₀t . El valor _C₀t es el producto de C₀ ₍ la concentración inicial de ADN), t (tiempo en segundos) y una constante que depende de la concentración de cationes en el tampón. El ADN repetitivo se renaturalizará a valores bajos de C₀t _, mientras que las secuencias de ADN complejas y únicas se renaturalizarán a valores altos de C₀t _. La rápida renaturalización del ADN repetitivo se debe a la disponibilidad de numerosas secuencias complementarias.

La filtración C0t es una técnica que utiliza los principios de la cinética de renaturalización del ADN para separar las _secuencias de ADN repetitivas que predominan en muchos genomas eucariotas de las secuencias de copia única/baja "ricas en genes". ^{[ 2 ]} Esto permite que la secuenciación del ADN se concentre en las partes del genoma que son más informativas e interesantes, lo que acelerará el descubrimiento de nuevos genes y hará que el proceso sea más eficiente. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

Fue desarrollado y utilizado por primera vez por Roy Britten y sus colegas en la Institución Carnegie de Washington en la década de 1960. ^{[ 5 ] [ 6 ]} Cabe destacar que fue mediante el análisis C ₀ t que se descubrió por primera vez la naturaleza redundante (repetitiva) de los genomas eucariotas . ^{[ 7 ]} Sin embargo, no fue hasta los revolucionarios experimentos de cinética de reasociación del ADN de Britten y sus colegas que se demostró que no todo el ADN codificaba genes. De hecho, sus experimentos demostraron que la mayor parte del ADN genómico eucariota está compuesto por elementos repetitivos no codificantes. ^{[ 1 ]}

• Análisis de Cot: Una visión general. Laboratorio de Exploración del Genoma de Mississippi.