Tomografía electrónica criogénica

Uno de los beneficios más citados de la crio-ET es la capacidad de reconstruir volúmenes 3D de objetos individuales (proteínas, células, etc. ) en lugar de requerir múltiples copias de la muestra en métodos cristalográficos o en otros métodos de imagen de crio-EM como el análisis de partícula única . ^{[ 7 ]} La crio-ET se considera un método in situ cuando se utiliza en una célula u otro sistema no perturbado, ya que la congelación por inmersión de muestras suficientemente delgadas fija la muestra en su lugar lo suficientemente rápido como para causar cambios mínimos en el posicionamiento atómico. ^{[ 8 ]} Las muestras gruesas, mayores de ~500  nm, requieren condiciones adicionales como alta presión para promover la vitrificación en toda la muestra.

En la microscopía electrónica de transmisión (TEM), debido a que los electrones interactúan fuertemente con la materia , las muestras deben mantenerse muy delgadas para evitar que se oscurezcan debido a múltiples eventos de dispersión elástica . Por lo tanto, en la crio-ET, las muestras generalmente tienen menos de ~500 nm de espesor. Por esta razón, la mayoría de los estudios de crio-ET se han centrado en complejos macromoleculares  purificados , virus o células pequeñas como las de muchas especies de bacterias y arqueas. ^{[ 1 ]} Por ejemplo, la crio-ET se ha utilizado para comprender la encapsulación de nanopartículas de jaula de proteína de 12 nm dentro de nanopartículas similares a virus de 60 nm. ^{[ 9 ]}  

Las células de mayor tamaño, e incluso los tejidos, pueden prepararse para la crio-ET mediante adelgazamiento, ya sea por criosección o por fresado con haz de iones focalizado (FIB). En la criosección, los bloques congelados de células o tejido se cortan en muestras delgadas con un criomicrótomo . [ ^{11 ] En} el fresado con FIB, las muestras congeladas por inmersión se exponen a un haz de iones focalizado, generalmente galio , que elimina con precisión el material de la parte superior e inferior de la muestra, dejando una lámina delgada adecuada para la obtención de imágenes mediante crio-ET. ^{[ 12 ]}

Para estructuras que están presentes en múltiples copias en uno o varios tomogramas,  se puede obtener una resolución más alta (incluso ≤1 nm) mediante el promedio de subtomogramas . ^{[ 13 ] [ 14 ]} De manera similar al análisis de partículas individuales, el promedio de subtomogramas combina computacionalmente imágenes de objetos idénticos para aumentar la relación señal-ruido .

Se sabe que la microscopía electrónica degrada rápidamente las muestras biológicas en comparación con las muestras en ciencia de materiales y física debido al daño por radiación . ^{[ 15 ]} En la mayoría de los demás métodos basados ​​en microscopía electrónica para la obtención de imágenes de muestras biológicas, la combinación de la señal de muchas copias diferentes de la muestra ha sido la forma general de superar este problema ( por ejemplo , cristalografía, análisis de partícula única). En la crio-ET, en lugar de tomar muchas imágenes de diferentes copias de la muestra, se toman muchas imágenes de una sola área. En consecuencia, la fluencia (número de electrones impartidos por unidad de área) en la muestra es aproximadamente 2-5 veces mayor que en el análisis de partícula única. ^{[ 16 ]} La tomografía en materiales mucho más resistentes permite una resolución drásticamente mayor que la obtención de imágenes biológicas típicas, lo que sugiere que el daño por radiación es la mayor limitación para la crio-ET de muestras biológicas. ^{[ 7 ] [ 17 ]}

La fuerte interacción de los electrones con la materia también produce un efecto de resolución anisotrópica. A medida que la muestra se inclina durante la obtención de imágenes, el haz de electrones interactúa con una muestra aparente más gruesa a lo largo del eje óptico del microscopio en ángulos de inclinación mayores. En la práctica, los ángulos de inclinación superiores a aproximadamente 60-70° no proporcionan mucha información y, por lo tanto, no se utilizan. Esto da como resultado una "cuña faltante" de información en el tomograma final que disminuye la resolución paralela al haz de electrones. ^{[ 6 ]}

El término "cuña faltante" se origina en la transformada de Fourier del tomograma, donde se observa una cuña vacía debido a que la muestra no se inclina a 90°. La cuña faltante resulta en una falta de resolución en la profundidad de la muestra, ya que la información faltante se encuentra principalmente a lo largo del eje z. La cuña faltante también es un problema en la cristalografía electrónica 3D , donde generalmente se resuelve mediante la fusión de múltiples conjuntos de datos que se superponen o mediante la expansión de simetría cuando es posible. ^{[ 15 ]} Ambas soluciones se deben a la naturaleza de la cristalografía, por lo que ninguna puede aplicarse a la tomografía.

Un obstáculo importante en la crio-ET es la identificación de estructuras de interés dentro de entornos celulares complejos. Soluciones como la microscopía de luz de criofluorescencia correlacionada ^{[ 19 ]} y la microscopía de luz de superresolución (por ejemplo, cryo-PALM ^{[ 20 ]} ) pueden integrarse con la crio-ET. En estas técnicas, una muestra que contiene una proteína de interés marcada con fluorescencia se congela rápidamente y primero se observa en un microscopio de luz equipado con una platina especial que permite mantener la muestra a temperaturas subcristalinas (< −150  °C). Se identifica la ubicación de la señal fluorescente y la muestra se transfiere al CryoTEM, donde la misma ubicación se observa a alta resolución mediante crio-ET.