Cristalización de proteínas

La cristalización de proteínas se rige por la misma física que rige la formación de cristales inorgánicos. Para que la cristalización ocurra espontáneamente, el estado cristalino debe ser termodinámicamente favorable. Esto se describe mediante la energía libre de Gibbs (∆G), definida como ∆G = ∆H - T∆S, que captura cómo el cambio de entalpía de un proceso, ∆H, se compensa con el cambio de entropía correspondiente , ∆S. ^{[ 10 ]} La entropía, en términos generales, describe el desorden de un sistema. Los estados altamente ordenados, como los cristales de proteínas, son termodinámicamente desfavorables en comparación con estados más desordenados, como soluciones de proteínas en disolvente, porque la transición a un estado más ordenado disminuiría la entropía total del sistema (∆S negativo). Para que los cristales se formen espontáneamente, el ∆G de la formación de cristales debe ser negativo. En otras palabras, la penalización entrópica debe pagarse mediante una disminución correspondiente de la energía total del sistema (∆H). Cristales inorgánicos comunes, como el cloruro de sodio, se forman espontáneamente en condiciones ambientales porque el estado cristalino disminuye la energía total del sistema. Sin embargo, la cristalización de algunas proteínas en condiciones ambientales disminuiría la entropía (∆S negativo) y aumentaría la energía total (∆H positivo) del sistema, por lo que no ocurre espontáneamente. Para lograr la cristalización de dichas proteínas, se modifican las condiciones para que la formación de cristales sea energéticamente favorable. Esto se suele conseguir mediante la creación de una solución sobresaturada de la muestra. ^{[ 3 ]}

La formación de cristales requiere dos pasos: nucleación y crecimiento . ^{[ 3 ]} La nucleación es el paso de iniciación para la cristalización. ^{[ 3 ]} En la fase de nucleación, las moléculas de proteína en solución se unen como agregados para formar un núcleo sólido estable. ^{[ 3 ]} A medida que se forma el núcleo, el cristal crece cada vez más a medida que las moléculas se unen a este núcleo estable. ^{[ 3 ]} El paso de nucleación es crítico para la formación de cristales, ya que es la transición de fase de primer orden de las muestras que pasan de tener un alto grado de libertad a obtener un estado ordenado (de acuoso a sólido). ^{[ 3 ]} Para que el paso de nucleación tenga éxito, la manipulación de los parámetros de cristalización es esencial. El enfoque para lograr que una proteína cristalice es producir una menor solubilidad de la proteína objetivo en solución. ^{[ 3 ]} Una vez que se supera el límite de solubilidad y están presentes los cristales, se logra la cristalización. ^{[ 3 ]}

La difusión de vapor es el método más comúnmente empleado para la cristalización de proteínas. En este método, se permite que gotas que contienen proteína purificada, tampón y precipitante se equilibren con un depósito más grande que contiene tampones y precipitantes similares en concentraciones más altas. Inicialmente, la gota de solución proteica contiene concentraciones relativamente bajas de precipitante y proteína, pero a medida que la gota y el depósito se equilibran, las concentraciones de precipitante y proteína aumentan en la gota. Si se utilizan las soluciones de cristalización adecuadas para una proteína determinada, se produce el crecimiento de cristales en la gota. ^{[ 11 ] [ 12 ]} Este método se utiliza porque permite cambios suaves y graduales en la concentración de proteína y de precipitante, lo que ayuda al crecimiento de cristales grandes y bien ordenados.

La difusión de vapor puede realizarse mediante el método de gota colgante o gota sésil. El aparato de gota colgante consiste en una gota de solución proteica colocada sobre un cubreobjetos invertido, que luego se suspende sobre el depósito. El aparato de cristalización de gota sésil coloca la gota sobre un pedestal separado del depósito. Ambos métodos requieren el sellado del entorno para que se produzca el equilibrio entre la gota y el depósito. ^{[ 11 ] [ 13 ]}

Un microprocesamiento generalmente implica sumergir un volumen muy pequeño de gotas de proteína en aceite (tan solo 1 μL). El aceite es necesario porque se utiliza un volumen tan pequeño de solución proteica y, por lo tanto, se debe inhibir la evaporación para llevar a cabo el experimento en medio acuoso. Si bien existen varios aceites que se pueden utilizar, los dos agentes de sellado más comunes son los aceites de parafina (descritos por Chayen et al.) y los aceites de silicona (descritos por D'Arcy). También existen otros métodos de microprocesamiento que no utilizan un agente de sellado líquido y, en su lugar, requieren que un científico coloque rápidamente una película o cinta adhesiva sobre una placa perforada después de depositar la gota en el pocillo.

Además de la escasa cantidad de muestra necesaria, este método presenta la ventaja adicional de que las muestras están protegidas de la contaminación atmosférica, ya que nunca se exponen al aire durante el experimento.

La microdiálisis aprovecha una membrana semipermeable , a través de la cual pueden pasar moléculas pequeñas e iones, mientras que las proteínas y los polímeros grandes no pueden atravesarla. Al establecer un gradiente de concentración de soluto a través de la membrana y permitir que el sistema alcance el equilibrio, este puede avanzar lentamente hacia la sobresaturación, momento en el que pueden formarse cristales de proteína.

La microdiálisis puede producir cristales mediante precipitación salina , empleando altas concentraciones de sal u otros compuestos pequeños permeables a la membrana que disminuyen la solubilidad de la proteína. En raras ocasiones, algunas proteínas pueden cristalizarse mediante precipitación salina por diálisis, dializando contra agua pura, eliminando solutos, lo que induce la autoasociación y la cristalización.

Esta técnica combina soluciones de proteína y precipitación sin mezclarlas previamente, inyectándolas a través de ambos lados de un canal, lo que permite alcanzar el equilibrio por difusión. Las dos soluciones entran en contacto en una cámara de reactivos, ambas a sus concentraciones máximas, lo que inicia la nucleación espontánea. A medida que el sistema alcanza el equilibrio, el nivel de sobresaturación disminuye, favoreciendo el crecimiento de los cristales. ^{[ 14 ]}

La fuerza impulsora básica para la cristalización de proteínas es optimizar el número de enlaces que se pueden formar con otra proteína a través de interacciones intermoleculares. ^{[ 3 ]} Estas interacciones dependen de las densidades electrónicas de las moléculas y las cadenas laterales de las proteínas que cambian en función del pH . ^{[ 10 ]} La estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas está determinada por las interacciones intermoleculares entre los grupos laterales de los aminoácidos, en los que los grupos hidrófilos suelen estar orientados hacia afuera de la solución para formar una capa de hidratación con el disolvente (agua). ^{[ 10 ]} A medida que cambia el pH, la carga en estos grupos laterales polares también cambia con respecto al pH de la solución y el pKa de la proteína . Por lo tanto, la elección del pH es esencial para promover la formación de cristales donde el enlace entre moléculas es más favorable que con moléculas de agua. ^{[ 10 ]} El pH es una de las manipulaciones más poderosas que se pueden asignar para la condición óptima de cristalización.

La temperatura es otro parámetro interesante a considerar, ya que la solubilidad de las proteínas depende de ella. ^{[ 15 ]} En la cristalización de proteínas, la manipulación de la temperatura para obtener cristales exitosos es una estrategia común. A diferencia del pH, la temperatura de los diferentes componentes de los experimentos de cristalografía puede afectar los resultados finales, como la temperatura de preparación del tampón, ^{[ 16 ]} la temperatura del experimento de cristalización propiamente dicho, etc.

Los aditivos químicos son pequeños compuestos químicos que se añaden al proceso de cristalización para aumentar el rendimiento de los cristales. ^{[ 17 ]} El papel de las moléculas pequeñas en la cristalización de proteínas no se había considerado bien en sus inicios, ya que en la mayoría de los casos se las consideraba contaminantes. ^{[ 17 ]} Se cree que las moléculas pequeñas ayudan si se incorporan como "puentes de empaquetamiento" en las interfaces de contacto del cristal. Actualmente no es posible (a fecha de 2017) determinar racionalmente qué moléculas pequeñas utilizar para mejorar las probabilidades de cristalización. ^{[ 18 ]}

Una forma clásica de cristalizar consiste en añadir una pequeña cantidad de proteasa a la gota, ya que la digestión puede producir un fragmento más cristalizable al eliminar las regiones no estructuradas.

La modificación química puede utilizarse para mejorar la cristalización. La más utilizada es la metilación reductiva, que modifica las lisinas superficiales de forma que suele reducir la entropía. ^{[ 18 ]}

Existen métodos de alto rendimiento que ayudan a optimizar la gran cantidad de experimentos necesarios para explorar las diversas condiciones requeridas para el crecimiento exitoso de cristales. Hay numerosos kits comerciales disponibles que utilizan ingredientes preensamblados en sistemas que garantizan una cristalización exitosa. Al usar uno de estos kits, el científico evita la complejidad de purificar una proteína y determinar las condiciones de cristalización adecuadas. ^{[ 19 ]}

Los robots de manipulación de líquidos pueden utilizarse para configurar y automatizar un gran número de experimentos de cristalización simultáneamente. Lo que de otro modo sería un proceso lento y potencialmente propenso a errores realizado por un humano, puede llevarse a cabo de manera eficiente y precisa con un sistema automatizado. Los sistemas robóticos de cristalización utilizan los mismos componentes descritos anteriormente, pero realizan cada paso del procedimiento rápidamente y con un gran número de réplicas. Cada experimento utiliza cantidades ínfimas de solución, y la ventaja de este menor tamaño es doble: las muestras más pequeñas no solo reducen el gasto de proteína purificada, sino que las menores cantidades de solución conducen a cristalizaciones más rápidas. Cada experimento es monitorizado por una cámara que detecta el crecimiento de los cristales. ^{[ 12 ]}

Las proteínas pueden modificarse genéticamente para mejorar la probabilidad de una cristalización exitosa. Un método común consiste en recortar la construcción recombinante para eliminar las partes N- y C-terminales, que con frecuencia están desordenadas o mal estructuradas ("alta entropía"). ^{[ 18 ]}

La reducción de la entropía superficial implica reemplazar grupos de residuos superficiales con alta entropía conformacional (generalmente lisina, glutamato y glutamina) por alaninas. ^{[ 20 ]} De manera similar, reemplazar la lisina por arginina en masa ha demostrado ser útil. ^{[ 21 ]} También es posible diseñar contactos cristalinos mediante la mutación de residuos. ^{[ 22 ]}

Un método aún más avanzado implica el uso de proteínas "chaperonas" conocidas por su mayor cristalización. Esto se puede lograr diseñando una proteína de fusión compuesta por la proteína de estructura desconocida y un dominio proteico conocido por su buena cristalización. La interacción en cuestión también puede ser intermolecular , por ejemplo, entre la proteína candidata y algunos fragmentos Fab de anticuerpos seleccionados para unirse fuertemente a la proteína, ^{[ 18 ]} o entre una proteína de fusión candidata -proteína de unión a maltosa (MBP) y una proteína diseñada específicamente para unirse a MBP. ^{[ 23 ]}

Muchos métodos de ingeniería de proteínas requieren cierto conocimiento previo de la estructura proteica, ya sea simplemente saber qué residuos son superficiales o internos, o conocer la estructura terciaria completa. Las herramientas modernas de predicción de la estructura proteica son, en general, suficientes. También es posible predecir el resultado de la cristalización utilizando estos métodos. ^{[ 24 ]}

Los residuos de cistina en la superficie suelen causar problemas en la producción de proteínas recombinantes debido a la agregación. Estos residuos pueden sustituirse por alaninas. Si bien esto no representa un problema para la cristalización en sí , es frecuente durante la determinación de la estructura.