Cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante

La cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC) es un método cromatográfico para la detección de sustituciones de bases, pequeñas deleciones o inserciones en el ADN. ^{[ 1 ]} Debido a su rapidez y alta resolución, este método es particularmente útil para encontrar polimorfismos en el ADN.

En la práctica, el análisis comienza con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar para amplificar el fragmento de interés. Si la región amplificada que presenta el/los polimorfismo(s) es heterocigota , el producto de la PCR contendrá dos tipos de fragmentos correspondientes al alelo y al alelo polimórfico silvestre. A este primer paso le sigue una etapa de desnaturalización - renaturalización para crear heterodúplex y homodúplex a partir de las dos poblaciones de alelos en la PCR. Para encontrar un polimorfismo homocigoto, se procede de la misma manera, premezclando una población de ADN silvestre con una población de ADN polimórfico para obtener heterodúplex después de la etapa de desnaturalización - renaturalización.

Los heterodúplex son, en realidad, cadenas dobles de ADN que contienen una cadena del alelo de tipo silvestre y una rama del alelo polimórfico. La formación de estos fragmentos de ADN provoca la aparición de un desajuste o apareamiento incorrecto en la zona donde se localiza el polimorfismo.

Estas discrepancias en el heterodúplex constituyen la base para la detección de polimorfismos mediante DHPLC. Los heterodúplex son térmicamente menos estables que sus homodúplex correspondientes, por lo que las hebras de ADN individuales se desconectan durante la cromatografía al someterse a una temperatura suficientemente alta. Esta inestabilidad de doble hebra provoca una discrepancia entre las dos hebras de ADN en la región de polimorfismo cuando el ADN se calienta hasta su punto de fusión . Esta discrepancia disminuye la interacción con la columna y reduce el tiempo de retención en comparación con los homodúplex durante el proceso de separación cromatográfica.

Para observar el fenómeno de separación, el método DHPLC utiliza una columna con una fase estacionaria porosa no injertada compuesta de poliestireno - divinilbenceno alquilo. Esta fase estacionaria es eléctricamente neutra e hidrofóbica . Sin embargo, el ADN tiene carga negativa en sus grupos fosfato y, por lo tanto, puede adsorberse en la columna. Para posibilitar la adsorción , se utiliza acetato de trietilamonio (TEAA). El ion amonio con carga positiva de estas moléculas interactúa con el ADN, y la cadena alquílica con la superficie hidrofóbica de la fase sólida.

Por lo tanto, cuando los heterodúplex se desnaturalizan parcialmente por calentamiento, las cargas negativas se redistribuyen parcialmente y la fuerza de interacción entre los heterodúplex de ADN y la columna disminuye en comparación con la fuerza de interacción de los homodúplex. En consecuencia, estos se eluirán más lentamente con la fase móvil (compuesta de acetonitrilo ).

La DHPLC se utiliza ampliamente como método de detección de mutaciones de alto rendimiento tanto en investigación como en aplicaciones de diagnóstico, pero las muestras con patrones cromatográficos alterados generalmente aún requieren secuenciación de ADN posterior para identificar la variante exacta. ^{[ 2 ]} Los primeros informes destacaron la instrumentación automatizada, análisis de aproximadamente 5 minutos por muestra y la capacidad de analizar fragmentos de PCR de hasta 1,5 kb. ^{[ 3 ]}