Parche dérmico

En 2016, se publicó un estudio de la Universidad de Nottingham que describía la primera seda de araña sintética funcionalmente idéntica a la seda de araña natural. Utilizando el análogo de metionina no natural L-azidohomoalanina (L-Aha) y células de E. coli genéticamente modificadas, se produjeron proteínas autoensamblables en las condiciones necesarias para crear el filamento. Estas condiciones habían sido investigadas años antes por J. Johansson y colaboradores en el estudio de la producción de proteínas de seda de araña. Las proteínas utilizadas en el estudio son una versión miniaturizada de los monómeros de seda que se encuentran en la naturaleza y que se comportan de la misma manera; gracias a las modificaciones, pudieron expresar regiones funcionalizadas de la proteína 4RepCT, una proteína de seda de arrastre recombinante autoensamblable, derivada de la araña de tela de nido a lo largo del eje del filamento. ^{[ 3 ]}

Los métodos para funcionalizar la proteína 4RepCT han tenido éxito, pero no de la forma que permite obtener una funcionalización estable y fiable en entornos biológicos, que además pueda ajustarse y modificarse. La fusión genética de secuencias peptídicas funcionales a genes de seda y la conjugación química de moléculas funcionales a cadenas laterales de aminoácidos son los únicos dos métodos conocidos actualmente para obtener una proteína 4RepCT funcionalizada con funcionalidad ajustable. El primer método tiene la ventaja de minimizar la manipulación postraduccional de la seda. Desafortunadamente, la manipulación genética es compleja debido al alto contenido de GC (guanina-citosina) del gen, lo que provoca errores de transcripción. Este método también limita la prevalencia de sitios de unión funcionales a un único sitio de unión de ligando por cada proteína de seda 4RepCT de 25 kDa. Se pueden utilizar proteínas adaptadoras grandes, como anticuerpos, para mostrar más sitios de unión, pero no se considera una solución viable. Se ha demostrado que este método produce proteínas 4RepCT con mayor adhesión celular que las proteínas de espidroína naturales y con diversas propiedades antimicrobianas. El segundo método, la modificación química de las proteínas de la seda, debería dar como resultado la unión covalente de varias copias de una amplia gama de ligandos orgánicos y organometálicos mediante enlaces robustos o sensibles, según la aplicación. El desafío de este método radica en la dificultad de lograr una modificación específica del sitio de la proteína 4RepCT. La focalización específica del sitio requiere que los residuos también se modifiquen para que sean accesibles y químicamente bioortogonales al resto de la proteína de la seda. Los residuos de citosina se utilizan comúnmente para este tipo de conjugación mediante una adición de Michael, pero tienden a sufrir reacciones de intercambio, lo que los hace inestables durante largos periodos en un entorno biológico. Estos dos métodos están algo desactualizados, pero han sido útiles para validar que la 4RepCT puede ajustarse en áreas importantes como la adhesión celular, la potencia antimicrobiana y el tipo de molécula o fármaco que se le une. ^{[ 3 ]}

Posteriormente, se conjugaron grupos funcionales azida al extremo N-terminal de una proteína de seda de arrastre mediante acoplamiento EDC/NHS, obteniendo películas conjugadas con glicopolímeros con adhesión celular mejorada y quimeras de ADN-seda con microarquitecturas controlables. Armados con esto, los investigadores de este estudio investigaron la incorporación de  3 residuos de L-Aha en 4RepCT, obteniendo${\displaystyle 4RepCT^{3Aha}}$Las cadenas laterales de azida de L-Aha permiten una conjugación sitio-específica y eficiente a muchas moléculas funcionales diferentes mediante la ligación de Staudinger con reactivos de fosfina, y la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (I) ( CuAAC ) o la cicloadición de azida-alquino promovida por tensión ( SPAAC ) en reacciones de clic. ^{[ 3 ]}

CuAAC y SPAAC son reacciones de clic comunes que a menudo son intercambiables en la química de clic. Es bien sabido que el Cu(I) intracelular es citotóxico, lo que significa que CuAAC no es tan común como las reacciones de clic SPAAC para la investigación que conduce a aplicaciones in vivo. Los investigadores de este estudio decidieron utilizar CuAAC, a pesar de que el propósito de esta investigación es tener aplicaciones in vivo, por algunas razones. Primero, la probabilidad de que el cobre se una a la${\displaystyle 4RepCT^{3Aha}}$La proteína es baja debido a la presencia de solo 2 residuos de ácido glutámico y ningún residuo de histidina (dos residuos con alta afinidad por Cu(I)). Estos residuos están presentes en la tiorredoxina, que es el socio de fusión solubilizante conjugado a la proteína 4RepCT durante la síntesis. Sin embargo, esto no causa problemas ya que la tiorredoxina se elimina para desencadenar la reacción de autoensamblaje con trombina que da como resultado la formación de la fibra. Esta eliminación de la tiorredoxina cargada con Cu(I) elimina prácticamente todo el cobre de la estructura de la seda. Los investigadores también, a través de un tampón que contiene EDTA y utilizando THPTA (que estabiliza los iones de cobre), enjuagaron las fibras lo que resultó en una mayor eliminación de Cu(I) dejando un  rastro de iones de cobre <0,1 % en peso. En segundo lugar, CuAAC supera a SPAAC en reacciones de clic donde están presentes proteínas con un alto contenido de citosina, como 4RepCT. El proceso SPAAC, en presencia de proteínas como 4RepCT, suele generar reacciones de "clic" en sitios no deseados, lo que provoca que el ligando se conjugue a la parte incorrecta de la proteína, dejándola prácticamente inservible. Para maximizar el número de sitios funcionales a lo largo de la fibra, se prefiere el proceso CuAAC. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

Este estudio demostró la conjugación mediada por CuAAC de${\displaystyle 4RepCT^{3Aha}}$con dos fluoróforos diferentes y el antibiótico levofloxacino, demostrando el potencial de las proteínas de seda de araña recombinantes funcionalizadas covalentemente como biomateriales con propiedades mejoradas. Los investigadores lograron conjugar con éxito${\displaystyle 4RepCT^{3Aha}}$con fluoróforos de alquino, demostrando que la proteína puede funcionalizarse mediante un grupo azida mientras está conjugada al eje de la fibra de seda. Sus resultados mostraron no solo una fluorescencia uniforme e intensa a lo largo del eje de la fibra, sino también una fluorescencia compuesta uniforme e intensa cuando la fibra se decoró con dos fluoróforos diferentes en una proporción 1:1. ^{[ 3 ]}

Para demostrar que el grupo azida funcional podía decorarse con una molécula clínicamente relevante, los investigadores intentaron decorar la fibra con éter glicidil propargílico (un enlazador lábil al ácido) y le unieron levofloxacino (un antibiótico dirigido a bacterias grampositivas) mediante un enlace éster entre los grupos epóxido carboxilato, respectivamente. Realizaron un ensayo de zona de inhibición con las fibras de seda funcionalizadas contra la bacteria E. coli NCTC 12242, donde cada nivel de factor contenía medio LB. Sus resultados mostraron una funcionalización exitosa de la fibra decorada con levofloxacino, que mantuvo una persistencia del antibiótico en un  radio de 3,5 cm durante 120 horas y una densidad celular de aproximadamente el 50 % de los otros niveles de factor (solo medio LB, seda sin funcionalizar y seda dopada con levofloxacino) con p ≤ 0,01. Se logró una liberación máxima sostenida de levofloxacino de la fibra durante 5 días. ^{[ 3 ]}

La seda de araña es uno de los primeros apósitos dérmicos conocidos. Utilizada principalmente para cerrar heridas, la glicoproteína adhesiva presente en la espiral de captura, así como la estructura proteica de la fibra, posee leves propiedades antibacterianas. La seda, al actuar como antiséptico local, redujo la incidencia de sepsis y enfermedades crónicas. Sus propiedades viscoelásticas, su alta resistencia a la tracción y su tenacidad favorecieron la cicatrización de heridas de forma similar a la cinta quirúrgica.

A pesar de su superioridad sobre los métodos actuales de cuidado de heridas extensas —vendajes con gasa, tratamientos con miel y vinagre, y antibióticos sistémicos— y su uso popular en parches dérmicos, la seda de araña no se ha incorporado a la práctica clínica. Históricamente, la principal razón es la dificultad de su cría y recolección. A diferencia de los gusanos de seda, que producen seda para diversas afecciones fáciles de reproducir, las arañas la producen para fines específicos, como la caza, difíciles de replicar en condiciones de laboratorio. Además, las arañas suelen ser caníbales, por lo que la cría de un número suficiente de ejemplares resulta difícil. La producción forzada de seda da como resultado sedas inadecuadas. Los casos de uso propuestos más populares para aplicaciones dérmicas son:

• Parche dérmico para la administración local de fármacos
• Apósitos antibióticos locales para heridas
• Andamios de reperfusión dérmica local
• Adhesivo cutáneo para mucosas para la fijación de dispositivos locales de administración de fármacos no adhesivos.

Las investigaciones muestran que la seda del gusano de seda no posee características antibióticas inherentes, ni propiedades mecánicas que imiten la biomimética, y puede causar reacciones alérgicas respiratorias fatales en algunas personas. ^{[ 5 ]}

Un estudio de 2020 reveló que las proteínas de seda de araña producidas por recombinación se autoensamblan en la interfase líquido-aire de una solución en reposo, formando membranas permeables a las proteínas, extremadamente resistentes y ultraflexibles. Este autoensamblaje espontáneo crea una membrana nanofibrilar que favorece el crecimiento celular. En tres días se forma una capa confluente de células de piel humana, apta para su administración directa a un paciente. ^{[ 6 ]}

Dado que la seda del gusano de seda puede ser mortal para los humanos al entrar en contacto con el sistema vascular, no existe ningún parche dérmico, ni ningún producto similar, aprobado para la aplicación de la seda del gusano de seda.