Dicroísmo lineal

La dicroísmo lineal (DL) utiliza luz polarizada linealmente , es decir, luz polarizada en una sola dirección. Esto produce una onda, el vector del campo eléctrico , que oscila en un solo plano, generando una forma de onda sinusoidal clásica a medida que la luz se propaga por el espacio. Al utilizar luz paralela y perpendicular a la dirección de orientación, es posible medir cuánta más energía se absorbe en una dimensión de la molécula en relación con la otra, lo que proporciona información al experimentador.

Cuando la luz interactúa con la molécula que se está investigando, si esta comienza a absorber la luz, la densidad electrónica en su interior se desplazará al fotoexcitarse el electrón . Este movimiento de carga se conoce como transición electrónica , cuya dirección se denomina polarización de transición eléctrica. La fotoluminiscencia (LD) es una propiedad que se mide.

El LD de una molécula orientada se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴

Donde A _║ es la absorbancia paralela al eje de orientación y A _┴ es la absorbancia perpendicular al eje de orientación.

Tenga en cuenta que se puede utilizar luz de cualquier longitud de onda para generar una señal LD.

Por lo tanto, la señal LD ​​generada tiene dos límites en cuanto a la señal que se puede generar. Para un sistema químico cuya transición eléctrica es paralela al eje de orientación, se puede escribir la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴ = A _║ > 0

Para la mayoría de los sistemas químicos, esto representa una transición eléctrica polarizada a lo largo de la molécula (es decir, paralela al eje de orientación).

Alternativamente, se puede encontrar que la polarización de la transición eléctrica es perfectamente perpendicular a la orientación de la molécula, dando lugar a la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴ = - A _┴ < 0

Esta ecuación representa la señal LD ​​registrada si la transición eléctrica está polarizada a lo ancho de la molécula (es decir, perpendicular al eje de orientación), que en el caso de LD es el menor de los dos ejes investigables.

Por lo tanto, la dicroísmo lineal (DL) puede utilizarse de dos maneras. Si se conoce la orientación de las moléculas en el flujo, el experimentador puede observar la dirección de polarización en la molécula (lo que proporciona información sobre la estructura química de la misma); o, si se desconoce la dirección de polarización, puede utilizarse para determinar el grado de orientación de una molécula en el flujo.

El ADN es casi ideal para la detección por LD UV. La molécula es muy larga y delgada, lo que facilita su orientación en flujo. Esto genera una fuerte señal de LD. Entre los sistemas de ADN estudiados mediante LD UV se incluyen complejos de ADN- enzima y complejos de ADN- ligando , ^{[ 2 ]} cuya formación se observa fácilmente mediante experimentos cinéticos.

Las proteínas fibrosas , como las implicadas en la enfermedad de Alzheimer y las proteínas priónicas , cumplen los requisitos para la fotoluminiscencia ultravioleta (UV LD), ya que son moléculas largas y delgadas. Además, las proteínas del citoesqueleto ^{[ 3 ]} también pueden medirse mediante fotoluminiscencia.

La inserción de proteínas de membrana en una membrana lipídica se ha monitorizado mediante dicroísmo lineal (DL), lo que proporciona al experimentador información sobre la orientación de la proteína con respecto a la membrana lipídica en diferentes momentos.

Además, se han analizado otros tipos de moléculas mediante UV LD, incluidos los nanotubos de carbono ^{[ 4 ]} y sus complejos de ligandos asociados.

El sistema de orientación por flujo de Couette es el método más utilizado para la orientación de muestras en dicroísmo lineal UV (DLV). Posee diversas características que lo hacen idóneo para la alineación de muestras. Actualmente, el flujo de Couette es el único método establecido para orientar moléculas en solución. Además, este método requiere cantidades muy pequeñas de muestra (20-40 μL) para generar un espectro de DLV. La recirculación constante de la muestra es otra ventaja del sistema, ya que permite realizar múltiples mediciones repetidas de cada muestra, reduciendo así el efecto del ruido en el espectro final registrado.

Su funcionamiento es muy sencillo: la muestra se coloca entre un tubo giratorio y una varilla fija. A medida que la muestra gira dentro de la celda, el haz de luz la atraviesa, calculándose la absorbancia paralela a partir de la luz polarizada horizontalmente y la absorbancia perpendicular a partir de la luz polarizada verticalmente. El láser UV de flujo de Couette es actualmente el único método de orientación de láseres disponible comercialmente.

El dicroísmo lineal de película estirada es un método de orientación que consiste en incorporar las moléculas de la muestra en una película de polietileno. ^{[ 5 ]} La película de polietileno se estira, lo que provoca que las moléculas orientadas aleatoriamente en la película sigan su movimiento. Como resultado del estiramiento, las moléculas de la muestra se orientan en la dirección del estiramiento.

La dicroísmo lineal ( DL) es muy similar al dicroísmo circular (DC), pero con dos diferencias importantes: (i) La espectroscopia de DC utiliza luz polarizada circularmente, mientras que la DL utiliza luz polarizada linealmente. (ii) En los experimentos de DC, las moléculas suelen estar libres en solución, por lo que su orientación es aleatoria. El espectro observado depende entonces únicamente de la quiralidad o asimetría de las moléculas en la solución. En el caso de las biomacromoléculas, el DC es particularmente útil para determinar la estructura secundaria. Por el contrario, en los experimentos de DL, las moléculas deben tener una orientación preferencial; de lo contrario, el DL es cero. Con las biomacromoléculas, se suele utilizar la orientación por flujo; otros métodos incluyen películas estiradas, campos magnéticos y geles comprimidos. Así, la DL proporciona información como la alineación en una superficie o la unión de una molécula pequeña a una macromolécula orientada por flujo, lo que le confiere una funcionalidad diferente a la de otras técnicas espectroscópicas. Las diferencias entre LD y CD son complementarias y pueden constituir un medio eficaz para dilucidar la estructura de las moléculas biológicas cuando se utilizan conjuntamente, ya que la combinación de ambas técnicas revela mucha más información que una sola técnica por separado. Por ejemplo, CD nos indica cuándo se pliega un péptido o proteína de membrana, mientras que LD nos indica cuándo se inserta en una membrana. ^{[ 6 ]}

El dicroísmo lineal detectado por fluorescencia (FDLD) es una técnica muy útil para el experimentador, ya que combina las ventajas del dicroísmo lineal UV (UV LD) y, además, ofrece la detección confocal de la emisión de fluorescencia. ^{[ 7 ]} El FDLD tiene aplicaciones en microscopía, donde puede utilizarse como método de mapeo de superficies bidimensionales mediante espectroscopia de polarización diferencial (DPS), donde la anisotropía del objeto escaneado permite registrar una imagen. El FDLD también puede utilizarse junto con colorantes fluorescentes intercalantes (que también pueden monitorizarse mediante UV LD). La diferencia de intensidad registrada entre los dos tipos de luz polarizada para la lectura de fluorescencia es proporcional a la señal UV LD, lo que permite el uso de DPS para obtener imágenes de superficies.