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Articulo de referencia

pirocarbonato de dietilo

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El pirocarbonato de dietilo ( DEPC ), también llamado dicarbonato de dietilo ( nombre IUPAC ), se utiliza en el laboratorio para inactivar las enzimas RNasa en el agua y en los utensilios de laboratorio. Lo hace mediante la modificación covalente de los residuos de histidina (con mayor intensidad), lisina , cisteína y tirosina . [ 1 ] [ 2 ]

Uso

Agua tratada con DEPC para uso en laboratorio.

En el laboratorio, se utiliza agua tratada con DEPC (y, por lo tanto, libre de RNasa) para manipular ARN y reducir el riesgo de que este sea degradado por las RNasas.

El agua se trata habitualmente con DEPC al 0,1 % v/v durante al menos 2 horas a 37  °C y, posteriormente, se esteriliza en autoclave (durante al menos 15 minutos) para inactivar los restos de DEPC. Esta inactivación produce CO₂ y etanol . Concentraciones más altas de DEPC pueden desactivar mayores cantidades de RNasa, pero los restos o subproductos pueden inhibir otras reacciones bioquímicas, como la transcripción in vitro. Además, es posible la modificación química del ARN, como la carboximetilación, cuando hay restos de DEPC o sus subproductos, lo que dificulta la recuperación del ARN intacto incluso después del intercambio de tampón (tras la precipitación).

El DEPC es inestable en agua y susceptible a la hidrólisis por dióxido de carbono y etanol, especialmente en presencia de un nucleófilo . Por esta razón, el DEPC no puede utilizarse con tampones Tris o HEPES . En cambio, puede utilizarse con solución salina tamponada con fosfato o MOPS . [ 3 ] Una regla práctica es que las enzimas o sustancias químicas que contienen grupos -O:, -N: o -S: activos no pueden tratarse con DEPC para eliminar la actividad de la RNasa, ya que el DEPC reacciona con estas especies. Además, los productos de degradación del DEPC pueden inhibir la transcripción in vitro.

La derivatización de histidinas con DEPC también se utiliza para estudiar la importancia de los residuos de histidina en las enzimas. La modificación de la histidina con DEPC da como resultado derivados carbometoxilados en el nitrógeno N-omega-2 del anillo de imidazol . La modificación de histidinas con DEPC puede revertirse mediante tratamiento con hidroxilamina 0,5 M a pH neutro.

El DEPC también puede utilizarse para analizar la estructura del ADN de doble cadena.

Referencias

  1. ↑ Chirgwin, John M; et  al. (1979). "Aislamiento de ácido ribonucleico biológicamente activo de fuentes enriquecidas en ribonucleasa". Biochemistry . 18 (24): 5294– 5299. doi : 10.1021/bi00591a005 . PMID 518835 . 
  2. ↑ Wolf, Barry; Lesnaw, Judith A.; Reichmann, Manfred E. (1970). "Un mecanismo de inactivación irreversible de la ribonucleasa pancreática bovina por dietilpirocarbonato. Una reacción general del dietilpirocarbonato con proteínas" . European Journal of Biochemistry . 13 (3): 519–25 . doi : 10.1111/j.1432-1033.1970.tb00955.x . PMID 5444158 . 
  3. ↑ "Preguntas frecuentes sobre DEPC" . Sigma-Aldrich . Consultado el 12 de agosto de 2012 .