Ensayo de dilución

El término ensayo de dilución se utiliza generalmente para designar un tipo especial de bioensayo en el que se administran una o más preparaciones (por ejemplo, un fármaco) a unidades experimentales en diferentes dosis, induciendo una respuesta biológica medible. Las dosis se preparan mediante dilución en un diluyente inerte respecto a la respuesta. Las unidades experimentales pueden ser, por ejemplo, cultivos celulares, tejidos, órganos o animales vivos. La respuesta biológica puede ser cuántica (por ejemplo, positiva/negativa) o cuantitativa (por ejemplo, crecimiento). El objetivo es relacionar la respuesta con la dosis, generalmente mediante técnicas de interpolación , y en muchos casos expresar la potencia/actividad de la(s) preparación(es) de prueba en relación con un estándar de potencia/actividad conocida.

Los ensayos de dilución pueden ser directos o indirectos. En un ensayo de dilución directo, se mide la cantidad de dosis necesaria para producir una respuesta específica (fija), de modo que la dosis es una variable aleatoria que define la distribución de tolerancia . Por el contrario, en un ensayo de dilución indirecto, las dosis se administran a niveles fijos, de modo que la respuesta es una variable aleatoria.

En algunos ensayos, puede haber razones de peso para creer que todos los componentes de la preparación de prueba, excepto uno, no tienen ningún efecto sobre la respuesta estudiada de los sujetos. Un ensayo de la preparación frente a una preparación estándar del componente efectivo equivale entonces a un análisis para determinar el contenido de dicho componente. Esto puede describirse como un ensayo de dilución analítica .

Para una definición matemática de un ensayo de dilución, un espacio de observación${\displaystyle U}$está definido y una función${\displaystyle f:U\rightarrow \mathbb {R} }$para que las respuestas ${\displaystyle u\in U}$se asignan al conjunto de números reales. Ahora se supone que una función${\displaystyle F}$existe que relaciona la dosis${\displaystyle z\in [0,\infty)}$a la respuesta

${\displaystyle f(u)=F(z)+e}$

en el cual${\displaystyle e}$es un término de error con esperanza 0.${\displaystyle F}$Por lo general, se asume que es continuo y monótono . En situaciones en las que se incluye una preparación estándar, se asume además que la preparación de la prueba ${\displaystyle T}$se comporta como una dilución (o concentración) del estándar${\displaystyle S}$

${\displaystyle F_{T}(z)=F_{S}(\rho z)}$, para todos${\displaystyle z}$

dónde${\displaystyle \rho >0}$es la potencia relativa de${\displaystyle T}$Este es el supuesto fundamental de similitud de las curvas dosis-respuesta, necesario para una definición significativa e inequívoca de la potencia relativa. En muchos casos, resulta conveniente aplicar una transformación de potencia.${\displaystyle x=z^{\lambda }}$con${\displaystyle \lambda >0}$o una transformación logarítmica${\displaystyle x=\log(z)}$. Se puede demostrar que este último es un caso límite de${\displaystyle \lambda \downarrow 0}$entonces si${\displaystyle \lambda =0}$Se escribe para la transformación logarítmica la ecuación anterior se puede redefinir como

${\displaystyle F_{T}(x)=F_{S}(\rho ^{\lambda }x)}$, para todos${\displaystyle x}$.

Estimaciones${\displaystyle {\hat {F}}}$de${\displaystyle F}$ are usually restricted to be member of a well-defined parametric family of functions, for example the family of linear functions characterized by an intercept and a slope. Statistical techniques such as optimization by Maximum Likelihood can be used to calculate estimates of the parameters. Of notable importance in this respect is the theory of Generalized Linear Models with which a wide range of dilution assays can be modelled. Estimates of ${\displaystyle F}$ may describe ${\displaystyle F}$ satisfactorily over the range of doses tested, but they do not necessarily have to describe ${\displaystyle F}$ beyond that range. However, this does not mean that dissimilar curves can be restricted to an interval where they happen to be similar.

In practice, ${\displaystyle F}$ itself is rarely of interest. More of interest is an estimate of ${\displaystyle \rho }$ or an estimate of the dose that induces a specific response. These estimates involve taking ratios of statistically dependent parameter estimates. Fieller's theorem can be used to compute confidence intervals of these ratios.

Some special cases deserve particular mention because of their widespread use: If ${\displaystyle F}$ is linear and ${\displaystyle \lambda >0}$ this is known as a slope-ratio model. If ${\displaystyle F}$ is linear and ${\displaystyle \lambda =0}$ this is known as a parallel line model. Another commonly applied model is the probit model where ${\displaystyle F}$ is the cumulative normal distribution function, ${\displaystyle \lambda =0}$ and ${\displaystyle e}$ follows a binomial distribution.

An antibiotic standard (shown in red) and test preparation (shown in blue) are applied at three dose levels to sensitive microorganisms on a layer of agar in petri dishes. The stronger the dose the larger the zone of inhibition of growth of the microorganisms. The biological response ${\displaystyle u}$ is in this case the zone of inhibition and the diameter of this zone ${\displaystyle f(u)}$ can be used as the measurable response. The doses ${\displaystyle z}$ are transformed to logarithms ${\displaystyle x=\log(z)}$ and the method of least squares is used to fit two parallel lines to the data. The horizontal distance ${\displaystyle \log({\hat {\rho }})}$ between the two lines (shown in green) serves as an estimate of the potency ${\displaystyle \rho }$ of the test preparation relative to the standard.

The major statistical software packages do not cover dilution assays although a statistician should not have difficulties to write suitable scripts or macros to that end. Several special purpose software packages for dilution assays exist.

• Finney, D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd Ed. Cambridge University Press, Cambridge. ISBN 0-521-08041-X
• Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay, 3rd Ed. Griffin, London. ISBN 0-02-844640-2
• Govindarajulu, Z. (2001). Técnicas estadísticas en bioensayos, 2.ª edición revisada y ampliada, Karger, Nueva York. ISBN 3-8055-7119-4

Software para ensayos de dilución:

• PLA
• Estadísticas combinadas
• Unistat
• Bioensayo