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Clonación por dilución

La clonación por dilución (también llamada clonación por dilución limitante o simplemente dilución limitante ) es una técnica que se utiliza para obtener una población monoclona...

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La clonación por dilución (también llamada clonación por dilución limitante o simplemente dilución limitante ) es una técnica que se utiliza para obtener una población monoclonal a partir de una mezcla celular heterogénea, distribuyendo las células a una densidad suficientemente baja como para que algunos compartimentos de cultivo (por ejemplo, pocillos) contengan una sola célula viable. Tras la expansión, los pocillos sembrados con una sola célula generan progenie clonal. Este método se utiliza ampliamente para aislar hibridomas y otros clones de células de mamíferos, y tiene aplicaciones en inmunología, microbiología , parasitología y biología de células madre . [ 1 ] [ 2 ]

Principio

La dilución limitante se basa en la distribución de Poisson para establecer la cantidad de células introducidas, de modo que una fracción significativa de los pocillos de cultivo reciba exactamente una célula (y muchos no reciban ninguna). Tras el cultivo en condiciones adecuadas (a menudo con células alimentadoras y factores de crecimiento), se examinan los pocillos para identificar proliferaciones monoclonales. Los marcos estadísticos para el diseño de la relación dosis-respuesta, el análisis y la estimación de las frecuencias de células iniciadoras de clones se detallan en la literatura inmunológica. [ 3 ]

Historia

Las primeras formas de dilución limitante para obtener cultivos microbianos puros datan del siglo XIX, y la clonación de bacterias mediante el aislamiento de colonias individuales en medios sólidos se estableció a finales del siglo XIX. [ 4 ]

En inmunología, el moderno sistema de microcultivo por dilución limitante para la clonación y cuantificación de precursores raros de linfocitos B y T se desarrolló en la década de 1970 en el laboratorio de Ivan Lefkovits en el Instituto de Inmunología de Basilea y posteriormente se formalizó con Herman Waldmann ; su monografía sigue siendo una referencia primaria para el método. [ 3 ] [ 5 ] [ 6 ] Las revisiones de la década de 1980 describieron la base teórica y las implementaciones experimentales para la clonación de linfocitos y el análisis de frecuencia. [ 7 ] [ 8 ] A Lefkovits se le atribuye ampliamente el desarrollo de la técnica de microcultivo para inducir células formadoras de anticuerpos en cultivos de dilución limitante de células de bazo de ratón . [ 9 ]

Aplicaciones

La clonación por dilución se utiliza para:

  • derivar líneas celulares de hibridomas monoclonales y recombinantes para la producción de anticuerpos ; [ 1 ]
  • clonar células T y células B para estudios funcionales y mapeo de especificidad de epítopos (a menudo con células alimentadoras y citocinas); [ 3 ] [ 10 ]
  • aislar parásitos y otros microbios a nivel de organismo individual; [ 11 ]
  • estimar las frecuencias de células precursoras raras (por ejemplo, precursores de linfocitos T citotóxicos o células madre hematopoyéticas ) utilizando marcos estadísticos LDA. [ 12 ] [ 13 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Freshney, R. Ian (2015). Cultivo de células animales: Manual de técnicas básicas y aplicaciones especializadas (7.ª  ed.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-118-87364-9.
  2. ↑ Sieburg, Hans B.; Cho, Rebecca H.; Muller-Sieburg, Christa E. (2002). "Análisis de dilución limitante para estimar la frecuencia de células madre hematopoyéticas: incertidumbre y significado". Hematología Experimental . 30 (12): 1436– 1443. doi : 10.1016/s0301-472x(02)00968-2 . PMID 12482502 . 
  3. 1 2 3 Lefkovits, Ivan; Waldmann, Herman (1999). Análisis de dilución limitante de células del sistema inmunitario (2.ª ed.). Oxford University Press. ISBN  0-19-850128-5.
  4. ↑ Weiss, Robin A. (2005). "Robert Koch: ¿el abuelo de la clonación?". Cell . 123 (5): 735– 738. doi : 10.1016/j.cell.2005.11.006 . PMID 16325570 . 
  5. ↑ Benner, R. (2005). "Disección de sistemas, poblaciones celulares y moléculas". Scandinavian Journal of Immunology . 61 (4): 299– 303. doi : 10.1111/j.1365-3083.2005.01611.x . PMID 15953186 . 
  6. ↑ Luzzati, Anna L. (2005). "Origen y desarrollo de una colaboración científica". Archivos Internacionales de Alergia e Inmunología . 138 (2): 129– 133. doi : 10.1159/000086183 . PMID 15953179 . 
  7. ↑ Lefkovits, Ivan; Waldmann, Herman (1984). "Análisis de dilución limitante de las células del sistema inmunitario I: la base clonal de la respuesta inmunitaria". Immunology Today . 5 (9): 265– 268. doi : 10.1016/0167-5699(84)90137-3 . PMID 25290326 . 
  8. ↑ Waldmann, Herman (1984). "Análisis de dilución limitante de células del sistema inmunitario II". Immunology Today . 5 (10): 298– 303. doi : 10.1016/0167-5699(84)90154-3 . PMID 25290547 . 
  9. ↑ "Imágenes de las personas y las ciencias del Instituto de Inmunología de Basilea" . ¿Qué es la biotecnología? El Consejo de Innovación en Ciencias Biomédicas y de la Vida . Consultado el 25 de octubre de 2025 .
  10. ↑ Waldmann, H.; Pope, H.; Lefkovits, I. (1975). "Análisis de dilución limitante de la función de las células T auxiliares" . Scandinavian Journal of Immunology . 4 (1): 135– 144. doi : 10.1111/j.1365-3083.1975.tb02675.x . PMC 1445909. PMID 50413 .  
  11. ↑ Butterworth, Alice S.; Robertson, Alan J.; Ho, Mei-Fong; Gatton, Michelle L.; McCarthy, James S. (2011). "Un método mejorado para realizar ensayos de dilución limitante para la clonación in vitro de parásitos de Plasmodium falciparum " . Malaria Journal . 10 (2) 95. doi : 10.1186/1475-2875-10-95 . PMC 3078993. PMID 21457528 .  
  12. ↑ Kaminski, Edward; Hows, Jill; Marti, GE (1991). "Optimización de un sistema de cultivo por dilución limitante para cuantificar frecuencias de precursores de linfocitos T citotóxicos alorreactivos". Inmunología Celular . 134 (1): 210– 222. doi : 10.1016/0008-8749(91)90059-K . PMID 1681904 . 
  13. ↑ Sieburg, Hans B.; Cho, Rebecca H.; Muller-Sieburg, Christa E. (2002). "Análisis de dilución limitante para estimar la frecuencia de células madre hematopoyéticas: incertidumbre y significado". Hematología Experimental . 30 (12): 1436– 1443. doi : 10.1016/s0301-472x(02)00968-2 . PMID 12482502 .