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tinción por dispersión

Las propiedades ópticas de todos los materiales líquidos y sólidos cambian en función de la longitud de onda de la luz utilizada para medirlos. Este cambio en función de la long...

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Las propiedades ópticas de todos los materiales líquidos y sólidos cambian en función de la longitud de onda de la luz utilizada para medirlos. Este cambio en función de la longitud de onda se denomina dispersión de las propiedades ópticas. La gráfica que se obtiene al representar la propiedad óptica de interés en función de la longitud de onda a la que se mide se denomina curva de dispersión.

La tinción por dispersión es una técnica analítica utilizada en microscopía óptica que aprovecha las diferencias en la curva de dispersión del índice de refracción de un material desconocido con respecto a un material estándar con una curva de dispersión conocida para identificar o caracterizar dicho material. Estas diferencias se manifiestan como un color cuando las dos curvas de dispersión se cruzan para una determinada longitud de onda visible. Se trata de una técnica de tinción óptica que no requiere colorantes ni tintes para producir el color. Su principal uso actual es la confirmación de la presencia de amianto en materiales de construcción [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] , pero tiene muchas otras aplicaciones. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

Tipos

Existen cinco configuraciones ópticas básicas del microscopio utilizadas para la tinción por dispersión. Cada configuración tiene sus ventajas y desventajas. Las dos primeras, la tinción por dispersión de la línea de Becke y la tinción por dispersión oblicua, fueron descritas por primera vez en Estados Unidos por F. E. Wright en 1911, basándose en el trabajo realizado por O. Maschke en Alemania durante la década de 1870. [ 10 ] Las cinco configuraciones de tinción por dispersión son:

  1. Tinción de dispersión de línea de Becke coloreada [ 11 ] (Maschke, 1872; Wright, 1911)
  2. Tinción por dispersión con iluminación oblicua (Wright, 1911)
  3. Tinción de dispersión de campo oscuro [ 12 ] (Crossmon, 1948)
  4. Tinción de dispersión por contraste de fase [ 13 ] (Crossmon, 1949)
  5. Tinción por dispersión de parada objetiva [ 14 ] (Cherkasov, 1958)

Todas estas configuraciones tienen los mismos requisitos para la preparación de la muestra a examinar. Primero, la sustancia de interés debe estar en contacto íntimo con el material de referencia conocido. En otras palabras, el sólido limpio debe estar montado en un líquido de referencia, una fase mineral debe estar en contacto íntimo con la fase mineral de referencia, o el líquido homogéneo debe contener el sólido de referencia. La mayoría de las aplicaciones implican un sólido montado en un líquido de referencia (denominado medio de montaje). Segundo, los colores de dispersión solo estarán presentes si los dos materiales tienen el mismo índice de refracción para alguna longitud de onda en el espectro visible (denominada λo) y tienen curvas de dispersión muy diferentes para el índice de refracción. Finalmente, la muestra debe estar correctamente montada bajo un cubreobjetos para minimizar cualquier otro efecto óptico que pueda complicar la interpretación del color observado. Una vez que se cumplen estos criterios, la muestra está lista para ser examinada.

La configuración inicial del microscopio para todos estos métodos es la iluminación Köhler correctamente ajustada . Se requieren algunos ajustes adicionales para cada uno de los métodos.

tinción de dispersión de la línea de Becke

El método de la línea de Becke aprovecha el hecho de que las partículas se comportan básicamente como lentes, ya que tienden a ser más delgadas en los bordes que en el centro. Si la partícula tiene un índice de refracción mayor que el líquido que la rodea, se comporta como una lente convexa y enfoca un haz de luz paralelo en el lado opuesto a la fuente de luz. Al observar a través del microscopio, esto se ve como un anillo brillante de luz, la línea de Becke, que se acerca desde el borde a medida que la partícula se desenfoca al aumentar la distancia entre la platina del microscopio y el objetivo. Si la platina se acerca al objetivo, la partícula se comporta como una lupa y la imagen de la línea de Becke se magnifica y aparece fuera de la partícula.

Estas son las líneas de Becke coloreadas de una esfera de vidrio que coincide con el índice de refracción del medio de montaje a una longitud de onda de 589 nanómetros.

Un requisito para este método es que el haz de luz incidente sea lo más paralelo posible. Esto exige el cierre del diafragma del condensador de la etapa secundaria. Al cerrar dicho diafragma, disminuye la resolución de la partícula y aumenta la profundidad de campo, donde otros objetos pueden interferir con el efecto observado. Para partículas grandes, esto no representa una limitación significativa, pero sí un problema para partículas pequeñas.

Cuando se dan las condiciones para la tinción por dispersión (la partícula se coloca en un líquido con un índice de refracción similar en el rango visible del espectro, pero con un índice de refracción muy diferente), la partícula presenta un índice de refracción alto en la parte roja del espectro y un índice de refracción bajo en la parte azul. Esto se debe a que los líquidos tienden a tener una curva de dispersión más pronunciada que los sólidos incoloros. Como resultado, cuando la partícula se desenfoca, las longitudes de onda rojas se enfocan hacia el interior. Para las longitudes de onda azules, la partícula se comporta como una lente cóncava y la línea de Becke azul se desplaza hacia el interior del líquido.

El color de estas dos bandas de luz variará según la coincidencia del índice de refracción entre la partícula y el líquido, es decir, la ubicación de λo. Si la coincidencia se encuentra cerca del extremo azul del espectro, la línea de Becke que se adentra en la partícula contendrá casi todas las longitudes de onda visibles, excepto el azul, y aparecerá como un amarillo pálido. La línea de Becke que se aleja aparecerá como un azul muy oscuro. Si la coincidencia se encuentra cerca del extremo rojo del espectro, la línea de Becke que se adentra en la partícula aparecerá como un rojo oscuro y la que se aleja aparecerá como un azul pálido. Si λo se encuentra cerca del centro de las longitudes de onda visibles, la línea de Becke que se adentra en la partícula será naranja y la que se aleja será azul celeste. Los colores observados (véase la Tabla 1) pueden utilizarse para determinar con gran precisión el índice de refracción de la sustancia desconocida o confirmar su identidad, como en el caso de la identificación del amianto. Ejemplos de este tipo de tinción por dispersión y los colores mostrados para diferentes λo pueden verse en http://microlabgallery.com/gallery-dsbecke.aspx . La presencia de dos colores ayuda a delimitar la longitud de onda en la que el índice de refracción coincide para ambos materiales.

Gráfico 1: Estos son los colores de tinción por dispersión asociados con diferentes longitudes de onda coincidentes cuando se utiliza cualquiera de los métodos que generan un par de colores.

El método de tinción por dispersión de la línea de Becke se utiliza principalmente como técnica exploratoria. Al escanear un campo de partículas y ajustar constantemente el enfoque fino, se observa un destello de color alrededor o dentro de una partícula, y se puede utilizar otro método para aumentar la sensibilidad y determinar la longitud de onda correspondiente. Para partículas grandes (de más de 25 micrómetros de diámetro), las líneas de Becke coloreadas pueden ser lo suficientemente nítidas como para determinar la longitud de onda con la precisión requerida. Para partículas muy grandes (de más de 100 micrómetros), este puede ser el mejor método, ya que es el menos sensible a otros tipos de interferencias ópticas.

Tinción por dispersión con iluminación oblicua

La tinción por dispersión con iluminación oblicua es el resultado de la refracción y la forma convexa de la mayoría de las partículas. Con la iluminación oblicua, el haz de luz que ilumina la muestra se dirige en un ángulo oblicuo a través de ella. Esto mejora la resolución de los detalles estructurales de la partícula que están orientados perpendicularmente al haz de luz incidente, aunque se pierde algo de resolución de las características paralelas a la dirección del haz. Debido a esta orientación del haz, se hace evidente el índice de refracción relativo de la partícula y el líquido de montaje. Las longitudes de onda para las que el líquido tiene un índice de refracción mayor se refractan hacia la lente frontal del objetivo desde el lado de la partícula más cercano al lado de donde proviene la luz. Si la partícula tiene un índice de refracción mayor para todas las longitudes de onda visibles, este lado de la partícula estará oscuro. El lado más alejado de la fuente de luz muestra todas las longitudes de onda para las que la partícula tiene un índice de refracción mayor. Estos efectos se observan con la partícula enfocada nítidamente. Esto supone una ventaja significativa sobre el método de la línea de Becke, ya que no es necesario desenfocar la partícula para observar los colores, y estos suelen ser más nítidos que los colores de dispersión de la línea de Becke. Los colores observados con este tipo de tinción por dispersión son prácticamente iguales a los del método de la línea de Becke, como se muestra en la Tabla 1. En el sitio web microlabgallery.com, en la sección de tinción por dispersión de la línea de Becke , se pueden consultar ejemplos de este tipo de tinción por dispersión y los colores mostrados para diferentes λo. La presencia de dos colores ayuda a delimitar la longitud de onda en la que el índice de refracción coincide para ambos materiales.

tinción de dispersión por iluminación de campo oscuro

La tinción por dispersión en iluminación de campo oscuro es el resultado de que la imagen de la partícula se forma únicamente por la luz refractada, mientras que toda la luz directa que incide sobre la muestra está orientada en un ángulo tal que no llega a la lente frontal del objetivo.

Este es el color que muestra una esfera de vidrio que coincide con el índice de refracción del medio de montaje a una longitud de onda de 589 nanómetros cuando se utiliza la tinción de dispersión de campo oscuro.

El resultado es que el fondo es negro. Todas las características de los objetos en el campo de visión que no coinciden con el índice de refracción del medio de montaje aparecen como blanco brillante. Cuando una partícula se monta en un líquido que coincide con su índice de refracción en algún punto del espectro visible, esas longitudes de onda no son refractadas por la partícula y no son captadas por el objetivo. La imagen del objeto se forma a partir de todas las longitudes de onda restantes. Estas longitudes de onda se combinan para producir un solo color que puede usarse para indicar qué banda de longitudes de onda falta (ver Gráfico 2). Ejemplos de este tipo de tinción por dispersión y los colores mostrados para diferentes λo pueden verse en el sitio web microlabgallery.com para tinción por dispersión en campo oscuro . Este método es más difícil de interpretar debido al color único en lugar de dos colores de acotación, pero es relativamente preciso cerca del centro del rango visible.

Gráfico 2: Estos son los colores de tinción por dispersión asociados con diferentes λo cuando se utiliza cualquiera de los métodos que generan un solo color.

tinción de dispersión por contraste de fase

La tinción por dispersión de contraste de fase requiere el uso de un objetivo de contraste de fase con el anillo de fase adecuado en el condensador de la platina para observar el efecto. Aprovecha el hecho de que los rayos de luz que no se desfasan por la presencia del objeto se separan de los rayos desfasados ​​en el plano focal posterior del objetivo.

Estos son los colores que muestra una esfera de vidrio que coincide con el índice de refracción del medio de montaje a una longitud de onda de 589 nanómetros cuando se utiliza la tinción por dispersión de contraste de fase.

Estos rayos no afectados disminuyen significativamente su intensidad. Con el "contraste de fase positivo", la partícula aparece coloreada según las longitudes de onda que contribuyen a la cual el medio de montaje tiene el índice de refracción más alto. Debido al tamaño físico de la placa de fase y su imagen en el plano focal posterior del objetivo donde se modifica, se forma un halo alrededor de la partícula. Este halo adquiere el color de las longitudes de onda combinadas para las cuales la partícula tiene el índice de refracción más alto. Los colores observados con este tipo de tinción por dispersión son similares a los del método de la línea de Becke que se muestra en la Tabla 1. Ejemplos de este tipo de tinción por dispersión y los colores mostrados para diferentes λo se pueden ver en el sitio web microlabgallery.com para la tinción por dispersión de contraste de fase . La presencia de dos colores ayuda a delimitar la longitud de onda en la cual el índice de refracción coincide para los dos materiales.

Tinción por dispersión de parada del objetivo

La tinción por dispersión con diafragma objetivo aprovecha el hecho de que toda la luz no alterada por la presencia de partículas en el campo de visión se enfoca en el plano focal posterior del objetivo. Si el diafragma del condensador de la platina está cerrado, toda la luz directa se enfoca en una pequeña imagen de la abertura del diafragma del condensador de la platina en el plano focal posterior del objetivo. Si se coloca un diafragma opaco en esa posición, toda la luz directa se bloquea y la imagen de la partícula se forma a partir de las longitudes de onda en las que las partículas y el líquido de montaje no coinciden. Estos colores son básicamente los mismos que los que se ven al usar la tinción por dispersión de campo oscuro. La doble apertura de este método mejora el efecto de color, pero también sacrifica la resolución de las partículas. En campos de visión donde las partículas pueden estar apiladas o muy próximas, puede ser difícil determinar con certeza qué partícula pequeña produce el color. Ejemplos de este tipo de tinción por dispersión y los colores mostrados para diferentes λo se pueden ver en el sitio web microlabgallery.com para la tinción por dispersión con diafragma objetivo . Este método es más difícil de interpretar debido al uso de un solo color en lugar de dos colores de delimitación, pero es relativamente preciso cerca del centro del rango visible.

Desarrollo histórico

Isaac Newton demostró que la luz “blanca” en realidad estaba compuesta de muchos colores “simples” diferentes y que los materiales tenían propiedades ópticas distintas según cuál de los colores simples se utilizara para medirlos. Demostró estos hechos con una serie de experimentos utilizando uno o más prismas. [ 15 ] La diferencia en las propiedades ópticas de los materiales en función de los colores “simples” o monocromáticos de la luz se denomina dispersión. También fue el primero en observar que los distintos materiales tenían propiedades de dispersión diferentes. Los líquidos “sulfurosos” (líquidos orgánicos) tenían un índice de refracción más alto del esperado según su densidad y una curva de dispersión más pronunciada que la mayoría de los sólidos. Estas observaciones, bien documentadas, tardarían poco más de dos siglos en convertirse en una técnica analítica.

El primer artículo que documentó los efectos de dispersión observados a través del microscopio fue escrito en 1872 por O. Maschke en Alemania. [ 16 ] Este artículo analizaba la aparición de líneas de Becke de colores cuando una partícula se encontraba en un líquido con un índice de refracción similar. Antes de este artículo, se creía que estos colores eran el resultado de las lentes del microscopio ( aberración cromática ) y no del sujeto montado en la lámina y el medio en el que estaba montado. En 1884 y 1895, Christian Christiansen publicó sus datos sobre la primera aplicación analítica de los colores de dispersión: el filtro de Christiansen . Descubrió que, al colocar un polvo transparente incoloro en un vial con un líquido orgánico incoloro, podía crear luz monocromática a partir de luz blanca si el líquido y el polvo tenían el mismo índice de refracción para esa longitud de onda. Solo esa longitud de onda vería un medio ópticamente homogéneo y pasaría directamente a través del vial. Las demás longitudes de onda serían dispersadas en todas direcciones por las partículas en el líquido. La luz monocromática podía observarse mirando a través del vial a lo largo de la trayectoria del haz de luz directo. En cualquier otro ángulo se observaría el color complementario de esa longitud de onda. Si elegía un líquido que coincidiera con el índice de refracción del polvo en la longitud de onda del rojo lejano, 700 nanómetros, podía crear cualquier otra longitud de onda calentando el vial, cambiando así la longitud de onda en la que coincidían el índice de refracción del polvo y el líquido. Esta técnica no funcionaba con cualquier polvo o líquido. Para obtener efectos óptimos, el polvo y el líquido debían seleccionarse cuidadosamente de modo que la intersección de sus curvas de dispersión creara el ángulo más grande posible en todo el rango de longitudes de onda visibles . El interés de Christiansen radicaba en la creación de filtros monocromáticos y no en el desarrollo de una técnica analítica. No fue hasta 1911 que FE Wright informó sobre el potencial analítico de los efectos de dispersión. [ 17 ] Observó que las líneas de Becke de colores señaladas por Maschke podían usarse para distinguir entre dos materiales con el mismo índice de refracción pero diferentes curvas de dispersión. Los colores también podían indicar la región del espectro de luz visible para la cual una partícula y el líquido en el que estaba montada tenían un índice de refracción coincidente. Wright también señaló que, al utilizar iluminación transmitida oblicua, la partícula mostraría estos colores sin necesidad de inspeccionar la línea de Becke.

La literatura técnica tuvo poca discusión adicional sobre los efectos de dispersión hasta 1948. Ese año, SC Crossmon, NB Dodge y los coautores RC Emmons y RN Gates escribieron artículos sobre el uso de los efectos de dispersión a través del microscopio para caracterizar partículas. [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] Crossmon parece haber acuñado el término "tinción de dispersión" como cualquier técnica óptica que utilizara el "efecto Christiansen" para producir color en la imagen de partículas incoloras. [ 21 ] Demostró el uso de los métodos de tinción de dispersión de línea de Becke, iluminación oblicua, campo oscuro y contraste de fase. SC Crossmon y WC McCrone han publicado numerosos artículos sobre el uso de técnicas de tinción de dispersión de diafragma de plano focal posterior del objetivo desde entonces. Yu. A. Cherkasov publicó un excelente artículo sobre este tema en 1958 y fue traducido al inglés en 1960. [ 22 ] Se han escrito más de 100 artículos sobre los diversos métodos de tinción por dispersión y su aplicación desde aproximadamente 1950 y la mayoría de ellos desde 1960.

A pesar de los primeros trabajos realizados sobre esta técnica, no fue hasta la década de 1950 que se popularizó entre los microscopistas. Actualmente, se reconoce como una herramienta poderosa para la caracterización de materiales y la detección de contaminantes en bajas concentraciones. Ha demostrado sensibilidad para detectar partículas contaminantes en polvos hasta el nivel de partes por millón.

La dispersión del índice de refracción es una propiedad fundamental de la materia. Puede considerarse como el resultado de la proximidad relativa de las frecuencias armónicas de los electrones de la capa externa de un compuesto a las frecuencias de la luz visible. La frecuencia armónica del electrón de enlace es el resultado de la energía de dicho enlace. Si el enlace es muy fuerte, la frecuencia será muy alta. Cuanto mayor sea la frecuencia, menor será el efecto que la diferencia de frecuencias entre el azul y el rojo tendrá sobre el índice de refracción. Para los enlaces de energía relativamente alta en la mayoría de los sólidos inorgánicos, esto significa que sus índices de refracción varían muy poco en el rango visible de frecuencias. Los índices de refracción de los compuestos orgánicos, por otro lado, con sus energías de enlace más bajas, varían significativamente en el rango visible. Esta diferencia en la dispersión es la base del efecto Christiansen y de los métodos de tinción por dispersión.

Notas y referencias

  1. ↑ "Copia archivada" (PDF) . Archivado del original (PDF) el 17-12-2008 . Recuperado el 19-07-2008 .{{cite web}}: CS1 mantenimiento: copia archivada como título ( enlace ) Método de prueba de asbesto a granel US-EPA 600/R-93/116 página 16
  2. ↑ "Copia archivada" (PDF) . Archivado del original (PDF) el 07-10-2008 . Recuperado el 19-07-2008 .{{cite web}}: CS1 maint: copia archivada como título ( enlace ) Método de prueba de asbesto a granel US-NIOSH 9002, páginas 4 y 5
  3. ↑Método de prueba de asbesto a granel D-191 de la OSHA de EE. UU., Sección 4.6
  4. ↑ Kohlbeck, JA y WT Bolleter, “Determinación microscópica del grado de nitración de la nitrocelulosa mediante tinción por dispersión”, JOURNAL OF APPLIED POLYMER SCIENCE, vol. 12, n.º 1, págs. 131-135, 1968
  5. ↑ Su, Shu-Chun, “Dispersion Staining - A versatile complement to Becke line method for refractive index determination”, GEOCHIMICA ET COSMOCHEMICA ACTA SUPPLEMENT, vol. 69, Issue 10, Supplement 1, Goldschmidt Conference Abstracts 2005, p.A727, 2005
  6. ↑Método del FBI de EE. UU. para caracterizar evidencia de vidrio traza
  7. ↑Caracterización de la composición química del mineral olivino
  8. ↑ Crutcher, ER, “Microscopía óptica: una herramienta importante para la identificación de fuentes de partículas”, ACTAS DE LA ASOCIACIÓN PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN DEL AIRE, página 272, 1981. Este artículo incluye la tinción por dispersión como parte del conjunto de métodos utilizados para identificar las fuentes de contaminación del aire en entornos urbanos.
  9. ↑ Crutcher, ER, “El papel de la microscopía óptica en los laboratorios analíticos aeroespaciales”, ACTAS DEL NOVENO SIMPOSIO DE SIMULACIÓN ESPACIAL, 1977. Este artículo incluye la tinción por dispersión como parte del conjunto de métodos utilizados para identificar las fuentes de contaminación en salas blancas aeroespaciales o microelectrónicas.
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