Hispanopedia WikiLa tecnología de matrices de diversidad (DArT) es una técnica de marcadores genéticos de alto rendimiento que puede detectar variaciones alélicas para proporcionar una cobertura genómica completa sin ninguna información de secuencia de ADN para genotipado y otros análisis genéticos. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] Los pasos generales implican reducir la complejidad del ADN genómico con enzimas de restricción específicas , elegir fragmentos diversos para servir como representaciones de los genomas parentales, amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), insertar fragmentos en un vector para colocarlos como sondas dentro de una matriz , y luego permitir que objetivos fluorescentes de una secuencia de referencia se hibriden con las sondas y se pasen por un sistema de imágenes. [ 1 ] [ 2 ] El objetivo es identificar y cuantificar varias formas de polimorfismo de ADN dentro del ADN genómico de las especies muestreadas. [ 1 ]
Informada por primera vez en 2001 por Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein y Kaiman Peng, DArT priorizó ventajas significativas sobre otros métodos tradicionales basados en cebadores, como la capacidad de analizar grandes cantidades de diversas muestras a partir de una pequeña cantidad de ADN inicial. [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] También ofreció bajos costos y resultados más rápidos en comparación con matrices de ADN de estado sólido relacionadas que detectaban polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [ 1 ] [ 2 ] Desde su inicio, la tecnología ha sido un instrumento importante en el análisis de plantas poliploides , así como en la construcción de mapas físicos y genéticos para comprender las relaciones entre especies basadas en similitudes y variaciones alélicas entre sus genomas. [ 1 ] [ 2 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 3 ]
Historia
El concepto fue desarrollado por primera vez por Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein y Kaiman Peng en 2001. [ 1 ] Su objetivo era establecer una técnica de detección y cuantificación de polimorfismos de ADN genómico que aumentara el rendimiento en comparación con métodos más tradicionales como el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y las repeticiones de secuencias simples (SSR). [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] También buscaban minimizar el costo y la dependencia de genomas secuenciados para identificar polimorfismos, lo cual es una consecuencia de los primeros arreglos de ADN inmovilizados en estado sólido, como los chips de ADN , que solo identifican SNP. [ 1 ] [ 2 ] Un subproducto de su descubrimiento de un método rápido y de bajo costo para el perfilado del genoma completo fue que también proporcionó la identificación de SNP, así como inserciones, deleciones y cambios de pares de bases, lo que constituye una capa adicional de variación alélica entre las especies analizadas. [ 1 ] [ 2 ]
Jaccoud, Kilian, Feinstein y Peng seleccionaron nueve subespecies de arroz como su fuente para el análisis de ADN genómico y polimorfismo. [ 1 ] El análisis consistió en detectar la presencia o ausencia de polimorfismos de ADN específicos con matrices de sondas, así como cuantificar la fuerza de cada señal, mediante fluorescencia, dentro de la subespecie. Después de seleccionar y extraer muestras de ADN de los sujetos, las muestras se digirieron con tres enzimas de restricción específicas y se ligaron con ligasa T4. Después de la ligación en ADN de doble cadena, se realizó la dilución y la extracción de una pequeña cantidad de mezcla para usar como plantilla de PCR. Los productos se colocaron en un vector pCR2.1-TOPO y posteriormente se transformaron en E. coli , que se seleccionaron en función de la resistencia a la ampicilina y la pigmentación de la interacción X-gal . [ 1 ] [ 2 ] Las células clonadas se amplifican con amplificación por PCR, se purifican y se introducen en una micromatriz. El ADN de referencia y las muestras se mezclaron con colorantes fluorescentes, Cy3 o Cy5, se desnaturalizaron y se dejaron hibridar para reintroducirlos en el microchip para su posterior análisis. Los resultados indicaron que el uso de DArT permitió detectar la presencia o ausencia de polimorfismos de manera más rápida que RFLP, así como cuantificar los polimorfismos detectados. [ 1 ] Además, DArT permitió minimizar significativamente la cantidad de ADN inicial necesaria para realizar el análisis en comparación con otros métodos. [ 1 ]
Procedimiento
El DArT se divide en tres pasos esenciales: reducción de complejidad, representación genómica y ensayo DArT. [ 2 ]
Reducción de la complejidad
Este paso del proceso consiste en reducir el ADN genómico complejo y extenso de especies seleccionadas a componentes fragmentados más manejables mediante el uso de enzimas de restricción específicas. Además, este paso se basa exclusivamente en enzimas de digestión en lugar de utilizar varias enzimas de digestión y cebadores, debido al mayor polimorfismo identificado en las muestras analizadas. [ 2 ] La enzima Pst I es una enzima de restricción comúnmente utilizada para este paso debido a su especificidad para el genoma no repetitivo y no metilado de las especies. [ 2 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]
Representación genómica
Una vez que el ADN genómico se ha reducido a un tamaño manejable mediante la incorporación de una o dos enzimas de restricción específicas, el siguiente paso consiste en seleccionar los fragmentos que contienen la mayor cantidad de polimorfismo significativo en todo el acervo genético . Estos fragmentos seleccionados se denominan "representaciones", ya que son representaciones más pequeñas del ADN genómico inicial, de mayor tamaño. Es fundamental evitar las secuencias repetitivas al seleccionar los fragmentos, ya que estas presentarán la menor cantidad de polimorfismo dentro del ADN genómico analizado. [ 2 ]
Ensayo DArT
Las secuencias digeridas se ligan utilizando la ligasa T4 para producir ADN de doble cadena. Una pequeña cantidad de la mezcla ligada se diluirá y luego se amplificará mediante PCR. Durante la PCR, es importante utilizar cebadores complementarios a los sitios de corte de las enzimas de restricción y la polimerasa RedTaq, que rara vez se inhibe. Mezclar el producto en una representación del banco de genes amplificada y ligarla al vector pCR2.1-TOPO. Después de la inserción de la representación en el vector, transformar el vector en células de E. coli mediante choque eléctrico o medios químicos. Incubar las células y seleccionar en función de la resistencia a la ampicilina y la pigmentación blanca del gen de la β-galactosidasa inactiva en un medio que contenga X-gal. [ 1 ] [ 2 ] Luego, los insertos se amplifican mediante PCR y se insertan como puntos en un portaobjetos de microarrays. Los portaobjetos se centrifugan para aislar los insertos, que luego se purifican.
Se añaden colorantes fluorescentes, Cy3 o Cy5, a las dianas del microarreglo, que son representaciones genómicas. Tras la adición del colorante fluorescente, las dianas se incorporan a las sondas del microarreglo que contienen los clones de E. coli amplificados , donde se produce la desnaturalización y la posterior hibridación, si es posible. Tras la hibridación, las láminas se lavan y se escanean con un sistema de imagen que detecta señales fluorescentes mediante el software de código abierto DArTsoft. Las interacciones y las diferencias entre la sonda y las distintas dianas se utilizan para generar un histograma que cuantifica e identifica diversas formas de polimorfismo del ADN entre los genomas analizados. [ 1 ] [ 2 ]
Aplicaciones
Reproducción molecular
La capacidad de identificar y cuantificar variaciones alélicas entre genomas sin necesidad de un genoma secuenciado es de gran valor para DArT y tiene importantes implicaciones en el sector del mejoramiento molecular . [ 1 ] [ 2 ] Al comparar cultivos con fenotipos como mayores rendimientos de producción o resistencia a ciertos parásitos ambientales, un fenotipo puede vincularse directamente a un polimorfismo de ADN identificado entre especies relacionadas mediante DArT. DArT también supera a otras técnicas de genotipado con poliploides debido a la ausencia de competencia de cebadores que se encuentra en otras técnicas. [ 2 ] Los poliploides se encuentran comúnmente entre cultivos de importancia agrícola. [ 2 ] Por ejemplo, DArT se ha utilizado para realizar análisis de todo el genoma entre especies de Musa , que incluyen bananos y plátanos, lo que llevó al desarrollo de un cladograma filogenético basado en marcadores genéticos derivados de técnicas DArT. Estos avances mejoran el conocimiento del mejoramiento para obtener rendimientos y productos deseables. [ 3 ]
También se está estudiando el reconocimiento acelerado de marcadores encontrados con genes responsables de fenotipos en animales con la ayuda de DArT. [ 2 ] [ 10 ] La resistencia de los mosquitos a los insecticidas se ha vinculado a mutaciones específicas en genes que confieren resistencia a ciertas especies de mosquitos sobre otras. [ 10 ] Se encontraron variaciones genotípicas a través de marcadores mientras se realizaba el análisis DArT en muestras relevantes.
Mapeo genómico
Dado que DArT puede encontrar relaciones genéticas entre especies dentro de un metagenoma de manera económica y rápida, ha sido fundamental para el desarrollo de mapas físicos y genéticos de especies estrechamente relacionadas. [ 2 ] [ 8 ] En sus inicios, DArT se utilizó para desarrollar cladogramas filogenéticos de subespecies de arroz basados en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN en el genoma de cada especie. [ 1 ] De la misma manera, DArT se incorporó a la fabricación de mapas genéticos para A. thaliana mediante la realización de una versión automatizada de DArT. [ 2 ] [ 9 ] El trigo, un hexaploide, es también otro cultivo que se ha beneficiado de la implementación de un análisis DArT, ya que se creó un cromosoma artificial bacteriano (BAC) del cromosoma más grande, 3B, a partir de marcadores detectados mediante ensayos DArT. [ 8 ] [ 11 ]
Referencias
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- Genética molecular
