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reacción en cadena de la polimerasa digital

La reacción en cadena de la polimerasa digital ( PCR digital , dPCR o dePCR ) es un perfeccionamiento biotecnológico de los métodos convencionales de reacción en cadena de la po...

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La reacción en cadena de la polimerasa digital ( PCR digital , dPCR o dePCR ) es un perfeccionamiento biotecnológico de los métodos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa que se puede utilizar para cuantificar directamente y amplificar clonalmente cadenas de ácidos nucleicos , incluyendo ADN , ADNc o ARN . La diferencia clave entre dPCR y qPCR radica en el método de medición de las cantidades de ácidos nucleicos, siendo la primera un método más preciso que la PCR, aunque también más propenso a errores en manos de usuarios inexpertos. [ 1 ] La PCR realiza una reacción por muestra. La dPCR también realiza una reacción dentro de una muestra, pero esta se divide en un gran número de particiones y la reacción se lleva a cabo en cada partición individualmente. Esta separación permite una recolección más fiable y una medición sensible de las cantidades de ácidos nucleicos. Se ha demostrado que el método es útil para estudiar variaciones en secuencias genéticas, como variantes del número de copias y mutaciones puntuales.

Principios

Dibujo animado con un tubo de microcentrífuga homogéneo etiquetado como "PCR tradicional, una medición de fluorescencia" y un segundo tubo que contiene muchas gotitas individuales etiquetadas como "PCR digital, miles de mediciones de fluorescencia distintas".
Comparación de PCR cuantitativa y PCR digital

El método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para cuantificar ácidos nucleicos mediante la amplificación de una molécula de ácido nucleico con la enzima ADN polimerasa . [ 2 ] La PCR convencional se basa en la teoría de que la amplificación es exponencial. Por lo tanto, los ácidos nucleicos pueden cuantificarse comparando el número de ciclos de amplificación y la cantidad de producto final de PCR con los de una muestra de referencia. [ 3 ] Sin embargo, muchos factores complican este cálculo, creando incertidumbres e imprecisiones. Estos factores incluyen: los ciclos de amplificación iniciales pueden no ser exponenciales; la amplificación por PCR eventualmente se estabiliza después de un número incierto de ciclos; y las bajas concentraciones iniciales de moléculas de ácido nucleico objetivo pueden no amplificarse a niveles detectables. Sin embargo, la limitación más significativa de la PCR es que la eficiencia de amplificación por PCR en una muestra de interés puede ser diferente a la de las muestras de referencia.

Dibujo animado que muestra muchas gotitas dentro de una emulsión de agua y aceite, donde el número de gotitas fluorescentes aumenta con la concentración de la molécula objetivo.
Gotas de aceite que contienen una molécula diana de PCR fluorescente.
Gráfico que muestra la concentración de la molécula objetivo predicha por la fracción de gotas fluorescentes, mostrando un aumento exponencial a medida que la fracción aumenta a 1 y el número de copias del objetivo por gota aumenta de 0 a 3.
La fracción de gotas positivas predice el número de copias objetivo por gota modelado por la distribución de Poisson.

En lugar de realizar una reacción por pocillo, la dPCR implica la partición de la solución de PCR en decenas de miles de gotas de tamaño nanométrico, donde se lleva a cabo una reacción de PCR independiente en cada una. [ 4 ] [ 5 ] Una solución de PCR se prepara de forma similar a un ensayo TaqMan , que consta de ADN (o ARN) molde, sondas extintoras de fluorescencia, cebadores y una mezcla maestra de PCR , que contiene ADN polimerasa , dNTPs , MgCl 2 y tampones de reacción en concentraciones óptimas. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para particionar las muestras, incluyendo placas de micropocillos, capilares, emulsión de aceite y matrices de cámaras miniaturizadas con superficies de unión de ácidos nucleicos. [ 6 ] La solución de PCR se divide en unidades más pequeñas, cada una con los componentes necesarios para la amplificación. Las unidades particionadas se someten a termociclado para que cada unidad pueda experimentar la amplificación de PCR de forma independiente. Después de múltiples ciclos de amplificación de PCR, se comprueba la fluorescencia de las muestras con una lectura binaria de "0" o "1". Se registra la fracción de gotas fluorescentes. [ 5 ] La partición de la muestra permite estimar el número de moléculas diferentes asumiendo que la población molecular sigue la distribución de Poisson , lo que explica la posibilidad de que múltiples moléculas objetivo habiten una sola gota. Utilizando la ley de Poisson de números pequeños, la distribución de la molécula objetivo dentro de la muestra se puede aproximar con precisión, lo que permite una cuantificación de la hebra objetivo en el producto de PCR. [ 7 ] Este modelo simplemente predice que a medida que aumenta el número de muestras que contienen al menos una molécula objetivo, aumenta la probabilidad de que las muestras contengan más de una molécula objetivo. [ 8 ] En la PCR convencional, el número de ciclos de amplificación de PCR es proporcional al número de copias inicial. A diferencia de la creencia de muchas personas de que la dPCR proporciona una cuantificación absoluta, la PCR digital utiliza potencia estadística para proporcionar una cuantificación relativa. Por ejemplo, si la muestra A, cuando se analiza en 1 millón de particiones, da una reacción positiva, no significa que la muestra A tenga una molécula inicial.

Entre las ventajas de la dPCR se incluye una mayor precisión gracias a la partición masiva de muestras, lo que garantiza mediciones fiables en la secuencia de ADN deseada debido a su reproducibilidad. [ 5 ] Las tasas de error son mayores al detectar pequeñas diferencias de cambio de pliegue con la PCR básica, mientras que son menores con la dPCR debido a las diferencias de cambio de pliegue más pequeñas que se pueden detectar en la secuencia de ADN. La técnica en sí reduce el uso de un mayor volumen de reactivo necesario, lo que inevitablemente disminuirá el costo del experimento. Además, la dPCR es altamente cuantitativa, ya que no depende de la fluorescencia relativa de la solución para determinar la cantidad de ADN diana amplificado.

Comparación entre dPCR y PCR en tiempo real (qPCR)

La dPCR mide el número real de moléculas (ADN diana) como cada molécula en una gota, lo que la convierte en una medición discreta y digital. Proporciona una cuantificación absoluta porque mide la fracción positiva de las muestras, que es el número de gotas que fluorescen debido a una amplificación adecuada. Esta fracción positiva indica con precisión la cantidad inicial de ácido nucleico molde. De manera similar, la PCR en tiempo real (qPCR) utiliza fluorescencia; sin embargo, mide la intensidad de la fluorescencia en momentos específicos (generalmente después de cada ciclo de amplificación) para determinar la cantidad relativa de la molécula diana (ADN), pero no puede especificar la cantidad exacta sin construir una curva estándar utilizando diferentes cantidades de un estándar definido. Proporciona el umbral por ciclo (CT) y la diferencia en CT se utiliza para calcular la cantidad de ácido nucleico inicial. Por lo tanto, la qPCR es una medición analógica, que puede no ser tan precisa debido a la extrapolación necesaria para obtener una medición. [ 6 ] [ 9 ]

La dPCR mide la cantidad de ADN una vez completada la amplificación y determina la fracción de réplicas. Esto representa una medición de punto final, ya que requiere la observación de los datos una vez finalizado el experimento. En cambio, la qPCR registra la fluorescencia relativa del ADN en puntos específicos durante el proceso de amplificación, lo que requiere pausas en el experimento. Este aspecto de "tiempo real" de la qPCR podría, en teoría, afectar los resultados debido a la interrupción del experimento. Sin embargo, en la práctica, la mayoría de los termocicladores de qPCR leen la fluorescencia de cada muestra muy rápidamente al final del paso de hibridación/extensión antes de pasar al siguiente paso de fusión, lo que significa que esta preocupación hipotética no es relevante ni aplicable para la gran mayoría de los investigadores. La dPCR mide la amplificación midiendo los productos del ciclo de PCR de punto final y, por lo tanto, es menos susceptible a los artefactos derivados de la disminución de la eficiencia de amplificación debido a la presencia de inhibidores de PCR o a la falta de coincidencia entre el cebador y la plantilla. [ 10 ] [ 11 ]

La PCR digital en tiempo real (rdPCR) combina las metodologías de la PCR digital (dPCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), integrando la precisión de la dPCR con las capacidades de análisis en tiempo real de la qPCR. Esta integración tiene como objetivo proporcionar una mayor sensibilidad, especificidad y la capacidad de cuantificación absoluta de secuencias de ácidos nucleicos, contribuyendo así a la cuantificación de material genético en la investigación científica y clínica. [ 12 ] [ 13 ]

La qPCR no puede distinguir diferencias en la expresión génica ni variaciones en el número de copias menores al doble. Por otro lado, la dPCR tiene mayor precisión y ha demostrado detectar diferencias menores al 30 % en la expresión génica, distinguir entre variaciones en el número de copias que difieren en solo 1 copia e identificar alelos que ocurren con frecuencias menores al 0,1 %. [ 14 ] [ 5 ]

Aplicaciones

La PCR digital tiene muchas aplicaciones en la investigación básica , el diagnóstico clínico y las pruebas ambientales. Sus usos incluyen la detección de patógenos y el análisis de la salud digestiva ; [ 15 ] [ 16 ] biopsia líquida para el monitoreo del cáncer , el monitoreo del rechazo de trasplantes de órganos y las pruebas prenatales no invasivas para anomalías genéticas graves ; [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] análisis de variación del número de copias , [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] análisis de expresión de un solo gen, [ 28 ] detección de secuencias raras, [ 24 ] [ 29 ] [ 30 ] perfil de expresión genética y análisis de células individuales ; [ 31 ] [ 32 ] [ 30 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] la detección de contaminantes de ADN en bioprocesamiento, [ 37 ] la validación de ediciones genéticas y detección de cambios de metilación específicos en el ADN como biomarcadores de cáncer , [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] así como la determinación del número de copias de plásmidos en poblaciones bacterianas. [ 41 ] La dPCR también se utiliza frecuentemente como método ortogonal para confirmar mutaciones raras detectadas mediante secuenciación de próxima generación (NGS) y para validar bibliotecas NGS . [ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]

Cuantificación absoluta

La dPCR permite la cuantificación absoluta y reproducible de ácidos nucleicos diana con resolución de molécula única. [ 30 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] En comparación con la PCR cuantitativa análoga (qPCR), la cuantificación absoluta con dPCR no requiere una curva estándar . [ 45 ] La dPCR también tiene una mayor tolerancia a las sustancias inhibidoras y a los ensayos de PCR que amplifican de forma ineficiente en comparación con la qPCR. [ 48 ] [ 11 ]

Ejemplos de aplicaciones son: Cuantificación de la presencia de secuencias específicas de organismos genéticamente modificados contaminantes en alimentos, [ 49 ] carga viral en la sangre, [ 50 ] PBMC , [ 51 ] [ 52 ] muestras de suero, [ 53 ] tejidos de vellosidades coriónicas , [ 51 ] [ 52 ] biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas en el líquido cefalorraquídeo, [ 54 ] y contaminación fecal en agua potable. [ 55 ]

Variación del número de copias

Una alteración en el estado del número de copias con respecto a un locus de referencia de copia única se denomina " variación del número de copias " (CNV) si aparece en células germinales, o alteración del número de copias (CNA) si aparece en células somáticas. [ 56 ] Una CNV o CNA podría deberse a una deleción o amplificación de un locus con respecto al número de copias del locus de referencia presente en la célula, y juntas, son importantes contribuyentes a la variabilidad en el genoma humano . [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] Se han asociado con cánceres; [ 60 ] [ 61 ] [ 62 ] enfermedades neurológicas, [ 63 ] psiquiátricas, [ 64 ] [ 65 ] y autoinmunes; [ 66 ] y reacciones adversas a medicamentos. [ 67 ] Sin embargo, es difícil medir estas variaciones alélicas con alta precisión utilizando otros métodos como la qPCR, lo que dificulta las asociaciones fenotípicas y de enfermedades con el estado alterado de CNV. [ 68 ] [ 69 ]

La gran cantidad de mediciones de punto final "digitalizadas" que permite la partición de muestras posibilita que la dPCR resuelva pequeñas diferencias en el número de copias con mayor exactitud y precisión en comparación con otros métodos como los microarrays basados ​​en SNP [ 70 ] o la qPCR. [ 71 ] [ 72 ] La qPCR tiene limitaciones en su capacidad para cuantificar con precisión las amplificaciones genéticas en varias enfermedades, incluyendo la enfermedad de Crohn , la infección por VIH-1 y la obesidad. [ 73 ] [ 69 ] [ 72 ]

La dPCR se diseñó para medir la concentración de un objetivo de ácido nucleico en copias por unidad de volumen de la muestra. Cuando se opera en reacciones diluidas donde menos del ~10% de las particiones contienen un objetivo deseado (denominado "dilución limitante"), el número de copias se puede estimar comparando el número de gotas fluorescentes que surgen de una CNV objetivo con el número de gotas fluorescentes que surgen de un locus de referencia de copia única invariante. [ 25 ] De hecho, tanto en estas concentraciones objetivo más bajas como en las más altas donde múltiples copias del mismo objetivo pueden colocalizarse en una sola partición, se utilizan estadísticas de Poisson para corregir estas ocupaciones múltiples y dar un valor más preciso para la concentración de cada objetivo. [ 74 ] [ 6 ]

La PCR digital se ha utilizado para descubrir variaciones tanto germinales como somáticas en el número de copias de genes entre humanos [ 75 ] y para estudiar el vínculo entre la amplificación de HER2 (ERBB2) y la progresión del cáncer de mama . [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ] [ 27 ]

Detección de mutaciones raras y alelos raros

La partición en PCR digital aumenta la sensibilidad y permite la detección de eventos raros, especialmente variantes de un solo nucleótido (SNV), al aislar o disminuir considerablemente la señal del biomarcador objetivo del fondo potencialmente competitivo. [ 9 ] [ 6 ] Estos eventos se pueden organizar en dos clases: detección de mutaciones raras y detección de secuencias raras.

Detección de mutaciones raras

La detección de mutaciones raras se produce cuando un biomarcador existe en presencia de una contraparte altamente abundante que difiere en una sola variante de nucleótido único (SNV). Se ha demostrado que la PCR digital es capaz de detectar ADN mutante en presencia de un exceso de 200 000 veces de ADN de tipo silvestre , lo que supone una sensibilidad 2000 veces mayor que la que se puede lograr con la qPCR convencional. [ 9 ]

Detección de secuencias raras

La PCR digital puede detectar secuencias raras como el ADN del VIH en pacientes con VIH, [ 24 ] y el ADN de bacterias fecales en muestras de agua de mar y otras aguas para evaluar la calidad del agua. [ 79 ] La dPCR puede detectar secuencias tan raras como 1 en cada 1.250.000 células. [ 24 ]

biopsia líquida

La capacidad de la dPCR para detectar mutaciones raras puede ser particularmente beneficiosa en la clínica mediante el uso de la biopsia líquida , una estrategia generalmente no invasiva para detectar y monitorear enfermedades a través de fluidos corporales. [ 17 ] [ 80 ] Los investigadores han utilizado la biopsia líquida para monitorear la carga tumoral, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer al medir mutaciones raras en el ADN tumoral circulante (ctDNA) en una variedad de fluidos biológicos de los pacientes, incluyendo sangre , orina y líquido cefalorraquídeo . [ 17 ] [ 81 ] [ 82 ] La detección temprana de ctDNA (como en la recaída molecular ) puede conducir a la administración más temprana de una inmunoterapia o una terapia dirigida específica para la firma de mutación del paciente, lo que potencialmente mejora las posibilidades de la efectividad del tratamiento en lugar de esperar una recaída clínica antes de modificar el tratamiento. Las biopsias líquidas pueden tener tiempos de respuesta de unos pocos días, en comparación con dos a cuatro semanas o más para las pruebas basadas en tejido. [ 83 ] [ 84 ] Este tiempo reducido para obtener resultados ha sido utilizado por los médicos para acelerar los tratamientos adaptados a los datos de la biopsia . [ 83 ]

En 2016, un ensayo prospectivo que utilizó dPCR en el Instituto de Cáncer Dana-Farber autentificó el beneficio clínico de la biopsia líquida como una herramienta de diagnóstico predictivo para pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas . [ 85 ] La aplicación de pruebas de biopsia líquida también se ha estudiado en pacientes con cáncer de mama , [ 86 ] colorrectal , [ 87 ] [ 88 ] ginecológico , [ 89 ] y vejiga [ 81 ] [ 90 ] para monitorear tanto la carga de la enfermedad como la respuesta del tumor al tratamiento.

Expresión génica y cuantificación de ARN

Los estudios de expresión génica y cuantificación de ARN se han beneficiado de la mayor precisión y cuantificación absoluta de la dPCR. [ 91 ] La cuantificación de ARN se puede realizar mediante RT-PCR , en la que el ARN se transcribe inversamente a ADNc en la propia reacción particionada, y el número de moléculas de ARN que se originan de cada transcrito (o transcrito alélico) se cuantifica mediante dPCR. [ 31 ]

A menudo se puede lograr mayor sensibilidad y precisión utilizando dPCR en lugar de qPCR para cuantificar moléculas de ARN, en parte porque no requiere el uso de una curva estándar para la cuantificación. [ 92 ] La dPCR también es más resistente a los inhibidores de PCR para la cuantificación de ARN que la qPCR. [ 48 ] [ 16 ] [ 91 ]

La dPCR puede detectar y cuantificar más especies objetivo individuales por canal de detección que la qPCR, gracias a su capacidad para distinguir objetivos en función de su amplitud de fluorescencia diferencial o mediante el uso de combinaciones de colores distintivas para su detección. [ 93 ] [ 91 ] Como ejemplo de esto, se ha utilizado un sistema de dPCR de 2 canales para detectar en un solo pozo la expresión de cuatro variantes de empalme diferentes de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana , una proteína que es más activa en la mayoría de las células tumorales que en las células sanas. [ 94 ]

Usos alternativos para el particionamiento

Utilizando las capacidades de partición dinámica empleadas en dPCR, se puede lograr una secuenciación NGS mejorada mediante la partición de reacciones de PCR complejas antes de la amplificación para obtener una amplificación más uniforme en muchos amplicones distintos para el análisis NGS . [ 95 ] [ 96 ] Además, se ha demostrado que la especificidad mejorada de las reacciones de amplificación de PCR complejas en gotas reduce en gran medida el número de iteraciones necesarias para seleccionar aptámeros de alta afinidad en el método SELEX . [ 97 ] La partición también puede permitir mediciones más robustas de la actividad de la telomerasa a partir de lisados ​​celulares. [ 98 ] [ 99 ] Las capacidades de partición dinámica de dPCR también se pueden utilizar para particionar miles de núcleos o células enteras en gotas individuales para facilitar la preparación de bibliotecas para un ensayo de célula única para cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación  (scATAC-seq). [ 100 ]

PCR digital de gotas

La PCR digital de gotas (ddPCR) es un método de dPCR en el que una reacción de muestra de 20 microlitros que incluye cebadores de ensayo y sondas Taqman o un colorante intercalante , se divide en ~20 000 gotas de aceite de tamaño nanométrico mediante una técnica de emulsión de agua-aceite , se termocicla hasta el punto final en una placa de PCR de 96 pocillos y se lee la amplitud de fluorescencia de todas las gotas en cada pocillo de muestra en un citómetro de flujo de gotas . [ 101 ] El número de copias génicas de los ensayos de ddPCR se ha utilizado para estimar la intensidad de infección de las enfermedades. [ 102 ] [ 103 ]

PCR digital basada en chips

La PCR digital basada en chips (dPCR) es también un método de dPCR en el que la mezcla de reacción (también utilizada en qPCR) se divide en entre ~10 000 y ~45 000 particiones en un chip, luego se amplifica utilizando una máquina de termociclado de PCR de punto final y se lee utilizando un lector de cámara de alta potencia con filtro de fluorescencia (HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 y Texas Red) para todas las particiones en cada chip. [ 104 ]

Historia

La dPCR surgió de un enfoque publicado por primera vez en 1988 por Cetus Corporation, cuando los investigadores demostraron que una sola copia del gen de la β-globina podía detectarse y amplificarse mediante PCR. [ 105 ] [ 106 ] Esto se logró diluyendo muestras de ADN de una línea celular humana normal con ADN de una línea mutante con una deleción homocigótica del gen de la β-globina, hasta que este ya no estuviera presente en la reacción. En 1989, Peter Simmonds, AJ Brown y otros utilizaron este concepto para cuantificar una molécula por primera vez. [ 107 ] Alex Morley y Pamela Sykes establecieron formalmente el método como una técnica cuantitativa en 1992. [ 46 ]

En 1999, Bert Vogelstein y Kenneth Kinzler acuñaron el término "PCR digital" y demostraron que la técnica podía utilizarse para encontrar mutaciones cancerosas raras. [ 108 ] Sin embargo, la dPCR era difícil de realizar; requería mucho trabajo, mucha capacitación para realizarla correctamente y era difícil realizarla en grandes cantidades. [ 108 ] En 2003, Kinzler y Vogelstein continuaron perfeccionando la dPCR y crearon un método mejorado que denominaron tecnología BEAMing , un acrónimo de "beads, emulsion, amplification and magnetics" (perlas, emulsión, amplificación y magnetismo). El nuevo protocolo utilizaba emulsión para compartimentalizar las reacciones de amplificación en un solo tubo. Este cambio permitió a los científicos escalar el método a miles de reacciones en una sola ejecución. [ 109 ] [ 110 ] [ 111 ] En 2007, Mikael Kubista , Stephen Bustin y colaboradores publicaron el primer estudio de dPCR utilizando la primera plataforma de nanolitros, con un mayor número de particiones, desarrollada por Fluidigm , para estudiar la distribución intracelular del ARNm. [ 112 ]

Las empresas que desarrollan sistemas dPCR comerciales han integrado tecnologías como la partición automatizada de muestras, el recuento digital de objetivos de ácido nucleico y el aumento del recuento de gotas que pueden ayudar a que el proceso sea más eficiente. [ 113 ] [ 114 ] [ 115 ] En los últimos años, los científicos han desarrollado y comercializado diagnósticos basados ​​en dPCR para varias afecciones, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el síndrome de Down . [ 116 ] [ 117 ] El primer sistema dPCR para uso clínico fue marcado CE en 2017 y aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. en 2019, para el diagnóstico de la leucemia mieloide crónica . [ 118 ]

Referencias

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