ELISpot

El ensayo ELISpot ( ensayo inmunoenzimático de puntos ) es un tipo de ensayo que se centra en la medición cuantitativa de la frecuencia de secreción de citocinas en una sola célula. El ensayo ELISpot también es una forma de inmunotinción, ya que se clasifica como una técnica que utiliza anticuerpos para detectar un analito proteico , entendiendo por analito cualquier sustancia biológica o química que se identifique o mida.

El ensayo FluoroSpot es una variante del ensayo ELISpot. Este ensayo utiliza fluorescencia para analizar múltiples analitos, lo que significa que puede detectar la secreción de más de un tipo de proteína.

Cecil Czerkinsky describió por primera vez ELISpot en 1983 como una nueva forma de cuantificar la producción de una inmunoglobulina antígeno-específica por células de hibridoma . En 1988, Czerkinsky desarrolló un ensayo ELISA de puntos que cuantificaba la secreción de una linfocina por células T. Ese mismo año, ELISpot de doble color se combinó por primera vez con imágenes computarizadas, lo que permitió la enumeración y el análisis de los puntos. 1988 también marcó el primer uso de placas con fondo de membrana para realizar estos ensayos. ^{[ 1 ]}

1. Recubrimiento de anticuerpos : Durante la técnica de ensayo ELISpot, se añaden y se eliminan diferentes sustancias de los pocillos. Estos se encuentran en una placa de laboratorio con pequeños recipientes que se llenan con la sustancia a analizar; la cantidad de pocillos en una placa varía, pero generalmente oscila entre 16 y 100. La primera sustancia que se añade a los pocillos son anticuerpos monoclonales específicos para citocinas. Estos anticuerpos recubren las paredes de los pocillos para su posterior unión a la citocina. Los anticuerpos monoclonales se producen a partir de un único linaje celular y solo pueden unirse a un epítopo proteico . Los anticuerpos policlonales , por otro lado, pueden unirse a múltiples epítopos de la misma proteína.
2. Incubación celular : Las células que se desean observar y analizar se añaden a los pocillos. Cada pocillo puede contener o no estímulos que activen la secreción de citocinas en las células. Durante la incubación, se permite que las células reaccionen a los estímulos presentes y secreten citocinas. Existen diversos procedimientos y métodos para garantizar un manejo celular adecuado. Para asegurar la alta calidad de las células, si se almacenan durante más de 3 horas, deben agitarse ligeramente; antes de almacenarlas, deben diluirse en PBS ( solución salina tamponada con fosfato ) y no deben contener granulocitos . Las células criopreservadas y descongeladas deben reposar durante una hora o más a 37 grados Celsius (temperatura corporal típica). ^{[ 2 ]} También hay muchas cosas que deben tenerse en cuenta al incubar las células, como asegurarse de que las células no experimenten movimientos bruscos que puedan afectar la formación de manchas, o que la humedad de la incubadora sea lo suficientemente alta para evitar la evaporación excesiva y el secado de los pocillos. ^{[ 3 ]}
3. Captura de citocinas : Dado que las células están rodeadas de anticuerpos monoclonales específicos para citocinas que recubren las paredes de los pocillos, la citocina secretada por las células incubadas comenzará a unirse a los anticuerpos en un epítopo específico.
4. Anticuerpos de detección : En este punto, se deben enjuagar los pocillos para eliminar las células y cualquier otra sustancia indeseable. Solo deben quedar los anticuerpos monoclonales específicos para la citocina y cualquier citocina que se haya unido a ellos. A continuación, se añaden al pocillo anticuerpos de detección específicos para la citocina biotinilados . Estos anticuerpos se unirán a cualquier citocina que quede en el pocillo, ya que esta aún está unida al primer conjunto de anticuerpos utilizados. Dado que la citocina se unió al primer conjunto de anticuerpos que recubrían los pocillos, no se eliminó al enjuagarlos.
5. Conjugado de estreptavidina-enzima : Se añade un conjugado de estreptavidina-enzima a los pocillos para que se una a los anticuerpos de detección. El objetivo de biotinilar los anticuerpos de detección específicos de citocinas añadidos a los pocillos en el paso anterior es que el anticuerpo pueda unirse al nuevo conjugado de estreptavidina-enzima. La biotinilación crea una fuerte afinidad entre la biotina del anticuerpo específico de citocinas y la estreptavidina del conjugado. ^{[ 4 ]}
6. Adición del sustrato : Se añade un sustrato a los pocillos, el cual es catalizado por el conjugado enzimático añadido en el paso anterior. Esta reacción forma un precipitado insoluble que crea manchas en los pocillos. El sustrato que se utilice en este paso dependerá del tipo de enzima empleada en el paso anterior. Si se utiliza estreptavidina-ALP (conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina ), el uso de BCIP/NBT-plus (una mezcla de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y cloruro de nitroazul de tetrazolio) ^{[ 5 ]} como sustrato producirá manchas más definidas y fáciles de analizar. Si se utiliza estreptavidina-HRP (conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante), el uso de TMB (tetrametilbencidina) ^{[ 6 ]} como sustrato producirá mejores resultados. ^{[ 7 ]}
7. Análisis : Las manchas que se forman pueden leerse en un lector ELISpot automatizado o contarse bajo un microscopio de disección, y utilizarse posteriormente para calcular la frecuencia de secreción de citocinas.

Los ensayos ELISpot y FluoroSpot se pueden utilizar en muchos campos de investigación: desarrollo de vacunas, ^{[ 10 ]} cáncer, ^{[ 11 ]} alergias, ^{[ 12 ]} caracterización de monocitos/macrófagos/células dendríticas, análisis de apolipoproteínas e investigación veterinaria ^{[las citas 10, 11 y 12 requieren actualización]} . Con ELISpot, puede estudiar respuestas de citocinas específicas de antígeno, células secretoras específicas de anticuerpos, ^{[ 13 ]} antígenos tumorales, ^{[ 11 ]} liberación de granzima B y perforina por células T, eficacia de vacunas, ^{[ 14 ]} mapeo de epítopos, ^{[ 15 ]} actividad de células T citotóxicas, detección de IL-4, IL-5 e IL-13, ^{[ 12 ]} respuestas de anticuerpos inducidas por vacunas, células B de memoria específicas de antígeno, ^{[ 10 ]} y mucho más.

Más específicamente, el ensayo ELISpot de células T se utiliza para caracterizar subpoblaciones de células T. Esto se debe a que el ensayo puede detectar la producción de las citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4, IL-5 e IL-13. Las tres primeras citocinas son producidas por las células Th1, mientras que las tres últimas son producidas por las células Th2. La medición de las respuestas de las células T a través de la producción de citocinas también permite estudiar la eficacia de las vacunas. ^{[ 16 ]}

Con T-cell FluoroSpot, puede monitorizar los linfocitos infiltrantes de tumores. También puede analizar la secreción de la citocina IFN-γ y la granzima B para evaluar las respuestas de las células T citotóxicas. Ambas se utilizan en la investigación del cáncer. ^{[ 17 ]}

Con B-cell FluoroSpot, también se puede observar la eficacia de la vacuna cuantificando la secreción de IgG, IgA e IgM antes y después de la vacunación. Este análisis de múltiples inmunoglobulinas es posible gracias al método de fluorescencia utilizado en FluoroSpot. ^{[ 17 ]}