Hispanopedia WikiEnhancer-FACS-seq ( eFS ), [ 1 ] [ 2 ] desarrollado por el laboratorio de Bulyk [ 3 ] en el Brigham and Women's Hospital y la Facultad de Medicina de Harvard , [ 4 ] es un ensayo de potenciadores altamente paralelo que tiene como objetivo la identificación de potenciadores transcripcionales activos y específicos de tejido , en el contexto de embriones completos de Drosophila melanogaster . Esta tecnología reemplaza el uso de la microscopía para la detección de potenciadores específicos de tejido con la clasificación celular activada por fluorescencia ( FACS ) de células disociadas de embriones completos, combinada con la identificación mediante secuenciación Illumina de alto rendimiento .
Introducción
Regulación transcripcional
En los metazoos , para responder al estrés ambiental, diferenciarse adecuadamente y progresar normalmente a través del ciclo celular, una célula eucariota necesita un programa de expresión génica específico y coordinado, que implica la transcripción altamente regulada de miles de genes. [ 5 ] Esta regulación génica está controlada en gran parte, de manera específica para cada tejido, por la unión de factores de transcripción a regiones genómicas no codificantes denominadas módulos cis-reguladores (CRM), [ 6 ] activando o reprimiendo la expresión génica al modular la estructura de la cromatina y, por lo tanto, teniendo un efecto positivo o negativo en la regulación de la transcripción . Los CRM que activan la expresión génica a menudo se denominan potenciadores transcripcionales , mientras que aquellos que la reprimen se denominan silenciadores transcripcionales .
Detección de potenciadores en Drosophila melanogaster
A pesar de ser un poderoso organismo modelo para la biología y el estudio de los potenciadores transcripcionales, se ha descubierto la actividad específica de tejido de menos del 5% de los 50.000 potenciadores transcripcionales estimados en Drosophila melanogaster . [ 7 ] [ 8 ] Durante la última década, el método principal para la detección de actividades específicas de tejido o tipo celular de potenciadores en Drosophila melanogaster fue probar potenciadores candidatos mediante ensayos reporteros tradicionales, [ 9 ] [ 10 ] que son de bajo rendimiento y costosos. En los últimos años, aunque el descubrimiento de potenciadores ha mejorado y se han desarrollado otros ensayos reporteros paralelos, [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] ninguno hasta ahora ha permitido la identificación directa de la actividad de potenciadores en un contexto genómico en tipos celulares de interés en un embrión completo.
Metodología
Cada CRM candidato (cCRM) se clona aguas arriba de un gen reportero . En comparación con los ensayos reporteros tradicionales, la principal innovación es el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de células disociadas, en lugar de la microscopía, para detectar potenciadores específicos de tejido. Este enfoque utiliza un sistema de dos marcadores: en cada embrión, un marcador (en este caso, la proteína de superficie celular CD2 de rata ) se utiliza para marcar las células de un tejido específico para su clasificación mediante FACS, y el otro marcador (en este caso, la proteína verde fluorescente GFP ) se utiliza como reportero de la actividad del CRM.
Las células se clasifican según su tipo de tejido y posteriormente mediante fluorescencia de GFP . Los cCRM se recuperan por PCR a partir de las células clasificadas doblemente positivas y del total de células de entrada. La secuenciación de alto rendimiento de ambas poblaciones permite medir la abundancia relativa de cada cCRM en las poblaciones de entrada y clasificadas; de este modo, se puede evaluar el enriquecimiento o la disminución de cada cCRM en las células doblemente positivas en comparación con las de entrada, como medida de la actividad en el tipo celular CD2 positivo que se está analizando.
Resultados significativos
En el informe inicial sobre este método, [ 17 ] se extrajo una biblioteca de ~500 cCRM de una variedad de fuentes de datos genómicos (por ejemplo, regiones unidas a TF, regiones unidas a coactivadores, sitios hipersensibles a DNasa I y predicciones del algoritmo PhylCRM del laboratorio de Bulyk [ 18 ] ) mediante PCR a partir de ADN genómico, y luego se examinó su actividad en el mesodermo embrionario y en tipos celulares mesodérmicos específicos. Los resultados se validaron mediante un ensayo tradicional de genes reporteros en embriones de Drosophila melanogaster para 68 cCRM probados por eFS. La especificidad de eFS fue excelente entre los cCRM significativamente enriquecidos, mientras que la sensibilidad fue buena donde la mayoría de las células CD2-positivas expresan GFP. Se encontró que las marcas de cromatina asociadas a potenciadores conocidas H3K27ac , H3K4me1 y Pol II están significativamente enriquecidas entre los potenciadores que se encontraron activos en el mesodermo .
Ventajas y aplicaciones futuras
Ventajas de eFS
- Identificación altamente paralela de potenciadores transcripcionales activos y específicos de tejido en embriones completos.
- Actividad de potenciadores candidatos analizada en un contexto genómico.
- Alta especificidad de los potenciadores detectados
Aplicaciones futuras
El ensayo eFS podría utilizarse para analizar otros tipos de células o tejidos. Al evaluar el enriquecimiento en células CD2-negativas y CD2-positivas que expresan GFP, y al cruzar una población común de moscas macho transformantes reporteras con hembras que expresan CD2 en diferentes tipos celulares, es posible evaluar tanto la especificidad como la actividad. En principio, acelerar la anotación del genoma regulador en Drosophila debería generar el tipo de datos de interacción reguladora a gran escala que permitirían explorar las propiedades de red de la regulación transcripcional.
Referencias
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- ↑ "Página principal del paquete de software PhylCRM" . Archivado del original el 4 de marzo de 2016. Consultado el 15 de diciembre de 2014 .
- expresión génica
