Despliegue del equilibrio

En bioquímica , el despliegue en equilibrio es el proceso de desplegar una molécula de proteína o ARN mediante cambios graduales en su entorno, como por ejemplo, modificando la temperatura o la presión , el pH , añadiendo desnaturalizantes químicos o aplicando fuerza, como con la punta de un microscopio de fuerza atómica . ^{[ 1 ] [ 2 ]} Si el equilibrio se mantuviera en todas las etapas, el proceso teóricamente debería ser reversible durante el plegamiento en equilibrio . El despliegue en equilibrio puede utilizarse para determinar la estabilidad termodinámica de la estructura de la proteína o el ARN, es decir, la diferencia de energía libre entre los estados plegado y desplegado .

En su forma más simple, el desplegamiento en equilibrio asume que la molécula puede pertenecer a solo dos estados termodinámicos: el estado plegado (generalmente denotado N, por estado "nativo") y el estado desplegado (generalmente denotado U ). Este modelo de plegamiento de proteínas de "todo o nada" fue propuesto por primera vez por Tim Anson en 1945, ^{[ 3 ]} pero se cree que solo es válido para dominios estructurales pequeños y únicos de proteínas (Jackson, 1998); los dominios más grandes y las proteínas multidominio a menudo presentan estados intermedios. Como es habitual en mecánica estadística , estos estados corresponden a conjuntos de conformaciones moleculares, no solo a una conformación.

La molécula puede transitar entre los estados nativo y desplegado según un modelo cinético simple.

N ⇌ U

con constantes de velocidad${\displaystyle k_{f}}$y${\displaystyle k_{u}}$para el plegado (${\displaystyle {\ce {U -> N}}}$) y desplegándose (${\displaystyle {\ce {N -> U}}}$) reacciones, respectivamente. La constante de equilibrio adimensional${\displaystyle K_{eq}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{u}}{k_{f}}}={\frac {\left[{\ce {U}}\right]_{eq}}{\left[{\ce {N}}\right]_{eq}}}}$puede utilizarse para determinar la estabilidad conformacional${\displaystyle \Delta G^{o}}$por la ecuación

${\displaystyle \Delta G^{o}=-RT\ln K_{eq}}$

dónde${\displaystyle R}$es la constante de los gases y${\displaystyle T}$es la temperatura absoluta en kelvin . Por lo tanto,${\displaystyle \Delta G^{o}}$es positivo si el estado desplegado es menos estable (es decir, desfavorecido) en relación con el estado nativo.

La forma más directa de medir la estabilidad conformacional${\displaystyle \Delta G^{o}}$La forma de medir una molécula con plegamiento de dos estados es medir sus constantes de velocidad cinética.${\displaystyle k_{f}}$y${\displaystyle k_{u}}$bajo las condiciones de solución de interés. Sin embargo, dado que el plegamiento de proteínas generalmente se completa en milisegundos, tales mediciones pueden ser difíciles de realizar, requiriendo por lo general costosos mezcladores de flujo detenido o (más recientemente) de flujo continuo para provocar el plegamiento con una alta resolución temporal. La interferometría de polarización dual es una técnica emergente para medir directamente el cambio conformacional y${\displaystyle \Delta G^{o}}$.

En la técnica menos extensa de despliegue en equilibrio , las fracciones de moléculas plegadas y desplegadas (denotadas como${\displaystyle p_{N}}$y${\displaystyle p_{U}}$Las fracciones (respectivamente) se miden a medida que las condiciones de la solución cambian gradualmente desde aquellas que favorecen el estado nativo a aquellas que favorecen el estado desplegado, por ejemplo, añadiendo un desnaturalizante como el hidrocloruro de guanidinio o la urea . (En el plegamiento en equilibrio , se lleva a cabo el proceso inverso). Dado que las fracciones deben sumar uno y su razón debe estar dada por el factor de Boltzmann , tenemos

${\displaystyle p_{N}={\frac {1}{1+e^{-\Delta G/RT}}}}$

${\displaystyle p_{U}=1-p_{N}={\frac {e^{-\Delta G/RT}}{1+e^{-\Delta G/RT}}}={\frac {1}{1+e^{\Delta G/RT}}}}$

La estabilidad de las proteínas suele variar linealmente con la concentración del agente desnaturalizante. Se han propuesto varios modelos para explicar esta observación, entre los que destacan el modelo de unión del agente desnaturalizante , el modelo de intercambio de disolvente (ambos de John Schellman ^{[ 4 ]} ) y el modelo de extrapolación lineal (LEM; de Nick Pace ^{[ 5 ]} ). Todos los modelos asumen que solo se pueblan/despoblan dos estados termodinámicos durante la desnaturalización. Estos modelos podrían extenderse para interpretar esquemas de reacción más complejos.

El modelo de unión del desnaturalizante supone que existen sitios específicos pero independientes en la molécula de proteína (plegada o desplegada) a los que el desnaturalizante se une con una constante de unión efectiva (promedio) k . El equilibrio se desplaza hacia el estado desplegado a altas concentraciones de desnaturalizante, ya que tiene más sitios de unión para el desnaturalizante en relación con el estado plegado (${\displaystyle \Delta n}$En otras palabras, el mayor número de sitios potenciales expuestos en el estado desplegado se considera la razón de las transiciones de desnaturalización. Un tratamiento elemental da como resultado la siguiente forma funcional:

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+k[D]\right)}$

dónde${\displaystyle \Delta G_{w}}$es la estabilidad de la proteína en agua y [D] es la concentración del agente desnaturalizante. Por lo tanto, el análisis de datos de desnaturalización con este modelo requiere 7 parámetros:${\displaystyle \Delta G_{w}}$,${\displaystyle \Delta n}$, k , y las pendientes e intersecciones de las líneas base de los estados plegado y desplegado.

El modelo de intercambio de solventes (también llamado "modelo de unión débil" o "solvatación selectiva") de Schellman evoca la idea de un equilibrio entre las moléculas de agua unidas a sitios independientes en la proteína y las moléculas desnaturalizantes en solución. Tiene la siguiente forma:

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+(K-1)X_{D}\right)}$

dónde${\displaystyle K}$es la constante de equilibrio para la reacción de intercambio y${\displaystyle X_{d}}$es la fracción molar del desnaturalizante en solución. Este modelo intenta responder a la pregunta de si las moléculas de desnaturalizante se unen realmente a la proteína o si parecen estar unidas simplemente porque los desnaturalizantes ocupan alrededor del 20-30% del volumen total de la solución a las altas concentraciones utilizadas en los experimentos, es decir, efectos no específicos, y de ahí el término "unión débil". Al igual que en el modelo de unión del desnaturalizante, el ajuste a este modelo también requiere 7 parámetros. Un tema común obtenido de ambos modelos es que las constantes de unión (en la escala molar) para la urea y el clorhidrato de guanidinio son pequeñas: ~ 0,2${\displaystyle M^{-1}}$para urea y 0,6${\displaystyle M^{-1}}$para GuHCl.

Intuitivamente, la diferencia en el número de sitios de unión entre los estados plegado y desplegado es directamente proporcional a las diferencias en el área de superficie accesible. Esto constituye la base del modelo LEM , que asume una dependencia lineal simple de la estabilidad con respecto a la concentración del desnaturalizante. La pendiente resultante de la gráfica de estabilidad frente a la concentración del desnaturalizante se denomina valor m. En términos puramente matemáticos, el valor m es la derivada del cambio en la energía libre de estabilización tras la adición del desnaturalizante. Sin embargo, Pace y colaboradores han documentado una fuerte correlación entre el área de superficie accesible (ASA) expuesta durante el desplegamiento, es decir, la diferencia en el ASA entre el estado desplegado y plegado de la proteína estudiada (dASA), y el valor m. ^{[ 5 ]} En vista de esta observación, los valores m se interpretan típicamente como proporcionales al dASA. El modelo LEM carece de una base física y es puramente empírico, aunque se utiliza ampliamente para interpretar datos de desnaturalización por solventes. Su forma general es:

${\displaystyle \Delta G=m\left([D]_{1/2}-[D]\right)}$

donde la pendiente${\displaystyle m}$se denomina " valor m " (> 0 para la definición anterior) y${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$(también llamado C _m ) representa la concentración de desnaturalizante a la cual el 50% de las moléculas están plegadas (el punto medio de desnaturalización de la transición, donde${\displaystyle p_{N}=p_{U}=1/2}$).

En la práctica, los datos experimentales observados a diferentes concentraciones de desnaturalizante se ajustan a un modelo de dos estados con esta forma funcional para${\displaystyle \Delta G}$, junto con líneas base lineales para los estados plegados y desplegados.${\displaystyle m}$y${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$son dos parámetros de ajuste, junto con otros cuatro para las líneas base lineales (pendiente e intersección para cada línea); en algunos casos, se supone que las pendientes son cero, lo que da un total de cuatro parámetros de ajuste. La estabilidad conformacional${\displaystyle \Delta G}$se puede calcular para cualquier concentración de desnaturalizante (incluida la estabilidad a concentración cero de desnaturalizante) a partir de los parámetros ajustados${\displaystyle m}$y${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$Cuando se combina con datos cinéticos sobre el plegamiento, el valor m puede utilizarse para estimar aproximadamente la cantidad de superficie hidrofóbica enterrada en el estado de transición del plegamiento.

Suponiendo una desnaturalización en dos estados como se indicó anteriormente, se pueden derivar los parámetros termodinámicos fundamentales, a saber:${\displaystyle \Delta H}$,${\displaystyle \Delta S}$y${\displaystyle \Delta G}$siempre que uno tenga conocimiento sobre el${\displaystyle \Delta C_{p}}$del sistema bajo investigación.

Las magnitudes termodinámicas observables de la desnaturalización pueden describirse mediante las siguientes ecuaciones:

${\displaystyle {\begin{aligned}\Delta H(T)&=\Delta H(T_{d})+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT\\&=\Delta H(T_{d})+\Delta C_{p}[T-T_{d}]\\\Delta S(T)&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\Delta C_{p}\ln {\frac {T}{T_{d}}}\\\Delta G(T)&=\Delta HT\Delta S\\&=\Delta H(T_{d}){\frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT-T\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&=\Delta H(T_{d})\left(1-{\frac {T}{T_{d}}}\right)-\Delta C_{p}\left[T_{d}-T+T\ln \left({\frac {T}{T_{d}}}\right)\right]\end{aligned}}}$

dónde${\displaystyle \ \Delta H}$,${\displaystyle \ \Delta S}$y${\displaystyle \ \Delta G}$indican la entalpía , la entropía y la energía libre de Gibbs del despliegue bajo un pH y una presión constantes. La temperatura,${\displaystyle \ T}$se varía para comprobar la estabilidad térmica del sistema y${\displaystyle \ T_{d}}$es la temperatura a la que la mitad de las moléculas del sistema están desplegadas. La última ecuación se conoce como la ecuación de Gibbs-Helmholtz .

Utilizando los principios anteriores, se han derivado ecuaciones que relacionan una señal proteica global, correspondiente a los estados de plegamiento en equilibrio, con el valor variable de un agente desnaturalizante, ya sea la temperatura o una molécula química, para proteínas homoméricas y heteroméricas, desde monómeros hasta trímeros y potencialmente tetrámeros. Estas ecuaciones proporcionan una base teórica sólida para medir la estabilidad de proteínas complejas y para comparar la estabilidad de proteínas de tipo silvestre y mutantes. ^{[ 7 ]} Dichas ecuaciones no pueden derivarse para pentámeros de oligómeros superiores debido a limitaciones matemáticas (teorema de Abel-Ruffini).

• Pace CN. (1975) "La estabilidad de las proteínas globulares", CRC Critical Reviews in Biochemistry , 1-43.
• Santoro MM y Bolen DW. (1988) "Cambios de energía libre de desplegamiento determinados por el método de extrapolación lineal. 1. Desplegamiento de la fenilmetanosulfonil α-quimotripsina utilizando diferentes desnaturalizantes", Biochemistry , 27 , 8063–8068.
• Privalov PL. (1992) "Base física de la estabilidad de las conformaciones plegadas de las proteínas", en Plegamiento de proteínas , TE Creighton, ed., WH Freeman, pp.  83–126.
• Yao M y Bolen DW. (1995) "¿Qué tan válidas son las mediciones de energía libre de desnaturalización inducida? Nivel de conformidad con supuestos comunes en un rango extendido de estabilidad de la ribonucleasa A", Biochemistry , 34 , 3771–3781.
• Jackson SE. (1998) "¿Cómo se pliegan las proteínas pequeñas de un solo dominio?", Folding & Design , 3 , R81-R91.
• Schwehm JM y Stites WE. (1998) "Aplicación de métodos automatizados para la determinación de la estabilidad conformacional de las proteínas", Methods in Enzymology , 295 , 150–170.